Биология в 3 томах. Tом 3 - Тейлор Д.
ISBN 5-03-003687-3
Скачать (прямая ссылка):
1. Плазмиды несут ген устойчивости к определенному антибиотику. Если в питательную среду, на которой выращивают бактерии, добавить этот антибиотик, то размножаться и формировать колонии смогут только трансформированные клетки (те, которые содержат плазмиды).
2. Плазмиды несут ген, кодирующий фермент ?-галактозидазу, причем этот ген дополнительно содержит несколько сайтов рестрикции, которые не влияют на функцию гена. ?-Галактозидаза — это фермент, расщепляющий лактозу на галактозу и глюкозу. При действии данного фермента на бесцветное вещество X-gal образуется продукт голубого цвета. Если чужеродная ДНК встроена в сайт рестрикции внутри гена, то ген не будет работать. Поэтому, если бактерии, которые выросли в присутствии антибиотика, выращивать затем на среде с X-gal, то колонии, не содержащие донорной ДНК, будут окрашены в голубой цвет. Бактерии же, образующие бесцветные колонии, содержат донорную ДНК,
ММА им. И.М. Сеченова
и их можно отбирать для последующего клонирования.
25.1.6. Отбор бактерий,
содержащих нужный ген
Если на первом этапе клонирования использовался метод «дробовика», то бактерии, включившие донорную ДНК, совсем не обязательно будут нести фрагмент ДНК с нужным геном. Донорная ДНК представляет собой смесь очень большого числа рестрикционных фрагментов (в случае ДНК человека — до миллиона). Даже в том случае, когда все эти фрагменты клонируются, нужный ген или участок ДНК будет содержать только один из них или несколько. Смесь клонов, полученных таким путем, называется библиотекой. Библиотеку можно также получить, если на первом этапе использовать обратную транскриптазу и смесь мРНК. Иногда это приходится делать, если нужную мPHК нельзя выделить в чистом виде. Таким образом, в тех случаях, когда клонировался не одиночный ген (синтезированный или считанный с мPHК одного типа), после четвертого этапа получают бактериальные культуры в виде библиотек.
Использование зондов
Нужную бактерию отбирают с помощью зонда, как это показано на рис. 25.9. Зонд можно использовать, если известна полная или частичная последовательность ДНК, которую требуется найти. Если же известна аминокислотная последовательность белка, который кодируется данным геном, то по ней можно предсказать последовательность нуклеотидов (по крайней мере, очень близкую к ней). В качестве зондов используют короткие фрагменты ДНК и РНК, которые комплементарны участку нужного гена и поэтому связываются с ним. Например, зонд АГТЦЦА найдет и присоединится с помощью водородных связей к последовательности ТЦАГГТ. Зонды могут быть очень короткими (15—20 нуклеотидов) или более длинными. Обычно зонд изготавливают из нуклеотидов, меченных радиоактивным элементом 32P. При связывании зонда с ДНК радиоактивность является маркером, который выявляют методом радиоавтографии (рис. 25.9).
БОТАНИКА
ММА им. И.М. Сеченова
Д. Тейлор, Н. Грин, У. Стаут. БИОЛОГИЯ, т. 3
Прикладная генетика
225
Бактериальная колония, содержащая плазм идный вектор
Удаление фильтра с чашки
Агар
Исходная чашка, содержащая библиотеку колоний
Бактерии и питательные вещества из агара проходят через фильтр, и бактерии начинают расти на поверхности фильтра, образуя копии(реплики)колоний, находящихся подними
Колония бактерий
Радиоактивно меченный зонд нуклеиновой кислоты, имеющий последовательность оснований, комплементарную разыскиваемой ДНК
Фильтр-реплика
Добавление щелочи для разрушения клеток, разделения двух це почечной ДНК на одиночные цепи и прикрепления ДНК к фильтру; при последующей отмывке удаляются остатки клеток
Одноцепочечная ДНК
Фильтр
Рентгеновская пленка
Радиоактивное излучение от связавшегося зонда засвечивает пленк (радиоавтография
Проявление пленки
Отмывка несвязавшегося зонда и наложение фильтра на рентгеновскую пленку
Сравнение пленки с исходной чашкой для идентификации колоний, содержащих разыскиваемую ДНК
_^ Приготовление культуры
из нужных колоний
Исходная чашка
Рис. 25.9. Скрининг библиотеки с помощью ДНК-зонда с целью обнаружения клона.
Запечатанный пластиковый пакет
Зонд «узнает* и связывается с комплементарной последовательностью оснований
БОТАНИКА
ММА им. И.М. Сеченова
Д. Тейлор, Н. Грин, У. Стаут. БИОЛОГИЯ, т. 3
226 Глава 25_
25.2. Использование бактерий, полученных с помощью методов генной инженерии
25.2.1. Инсулин человека
Инсулин — это белковый гормон, который образуется в поджелудочной железе и играет жизненно важную роль в регуляции содержания сахара в крови (разд. 17.6.6). Недостаток инсулина служит одной из причин сахарного диабета — заболевания, которым страдает примерно 3% населения Земного шара. Повышенное содержание сахара в крови (обусловленное недостатком инсулина) приводит к тяжелым последствиям. Болезнь стала излечимой, начиная с 1921 г, когда два канадских исследователя Бантинг (Banting) и Бест (Best) впервые выделили гормон. До этого больные страдали от тяжелых изнурительных симптомов, приводящих к неминуемой смерти. Сейчас более 2 млн. больных диабетом во всем мире пользуются для лечения инсулином (рис. 25.10), а его продажа на мировом рынке оценивается в несколько сотен миллионов фунтов стерлингов ежегодно.
