Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
TCNQ~ скорость реакции достаточно велика для того, чтобы расходовался
весь субстрат, диффундирующий через мембрану.
Как видно из табл. 12.3, для всех трех ферментов значения сходны и близки
к наблюдаемым для глюкозооксидазы. Это и не удивительно. Для диализной
мембраны
Амперометрические ферментные электроды
167
Рис. 12.10. Типичные сигналы ферментных электродов при увеличении
концентрации соответствующего субстрата: а-ксантиноксидазы; 6-D-
аминокислотной ( + ) и L-аминокислотной СП) оксидазы: в-холиноксидазы.
Материал электрода во всех случаях -TT1-TCNQ .
можно было ожидать значения ks, близкого к единице, и, следовательно,
отличающиеся значения k's для разных субстратов отражают различия в их
коэффициентах диффузии. Маловероятно, что эти различия велики для близких
по размеру субстратов.
По величинам отрезков, отсекаемых на оси у зависимостями р(р) (рис.
12.11), с помощью уравнения (12.20) можно найти КМЕ. Как и в случае
глюкозооксидазы, полученные значения КМЕ, очевидно, определяются
соотношением между кинетикой транспорта субстрата и окисления фермента на
электроде:
К.
к' е^/км
(12.25)
где к'-константа скорости электрохимического окисления фермента. Из табл.
12.3 видно, что все значения к' больше 10"4 см-с-1. Такие высокие
значения констант скоростей электрохимических процессов еще раз
подтверждают преимущества использования органических проводников в
качестве электродных материалов для ферментов. Таблица 12.3.
Характеристики ферментных электродов
Фермент k's, см-с 1 кмь, ммоль/дм3 к. см с 1
Ксантиноксидаза 1,1 ¦ 1СГ4 0,2 3,7 - 10~4
D-Аминокислотная оксидаза 2.6- КГ5 1.1 2,4- 1СГ4
L-Аминокислотная оксидаза 2,8 • 10"5 2,6 4,6-10 2
Холиноксидаза 2,8 • 10"4 1,8 3,0 10"3
168
Глава 12
<1
Рис. 12.11. Зависимости у (р), рассчитанные по данным рис. 12.10 с
помощью уравнения (12.20) для электродов па основе ксантиноксидазы (а),
D-амино-кислотной (б) и L-аминокислотной оксидазы (в).
Амперометрические ферментные электроды
169
Рис. 12.12. Зависимость у (р) для холиноксидазного электрода,
рассчитанная по данным рис. 12.10 с помощью уравнения (12.20).
Обратимся к холиноксидазе. Это несколько более сложная система, поскольку
продукт ферментативного окисления холина, бетаиновый альдегид, сам может
служить субстратом для данного фермента. Для упрощения анализа мы
использовали бетаиновый альдегид в качестве субстрата ферментного,
электрода. На рис. 12.12 приведена зависимость г(р) для данной системы.
Эта зависимость также линейна, но пересекает ось абсцисс при р0 х + 2, а
не при р0 = +1, как в предыдущих случаях. Согласно уравнениям (12.20) и
(12.21), значение р0, равное + 2, означает, что кинетика ферментативной
реакции и транспорт субстрата вносят равный вклад в наблюдаемую константу
скорости к'МЕ. И в этом случае рассчитанное по уравнению (12.21) значение
k's (табл. 12.4) близко к значениям этой же константы для других
субстратов. В табл. 12.4
Таблица 12.4. Скоростьопределяклцие стадии, соответствующие различным
значениям Кки и р*
^МЕ < Км КМЕ = Км *МЕ > Км
Ро = 1 Транспорт Электрохимическая реакция Транспорт
Электрохимическая реакция } Транспорт 9
р0 = со Ферментативная реакция Электрохимическая реакция
Ферментативная реакция Ферментативная реакция Ферментативная
реакция Неопределенная ситуация
* Для каждой комбинации р0 и КМЕ вверху указана скоростьопределяющая
стадия при низких, а внизу-при высоких концентрациях субстрата.
приведена также константа скорости электрохимической реакции к',
найденная описанным выше способом. Важно, что полученное значение к'
достаточно велико- 10~3см-с-1.
170
Глава 12
12.12. NADH-электроды
Обсудим теперь различные варианты применения электродов из органического
проводящего материала с ферментами, которые имеют один и тот же кофактор-
NAD + /NADH. По нашим данным [2], константа скорости электрохимического
окисления NADH на электроде из проводящей органической соли NMP + TCNQ-
достигает 10-2см-с-1. На основе этого материала мы разработали ферментный
электрод, в котором для окисления ряда различных спиртов, таких как
этанол, бутанол-1 и пропанол-2, используется дрожжевая
этанолдегидрогеназа (ЕС 1.1.1.1). Схема реакций для такого электрода
рассмотрена в разделе 12.5.
На рис. 12.13 показано, как увеличивается ток ферментного NADH-электрода
с ростом концентрации этанола. По этим данным описанным выше способом
рассчитана зависимость у(р) (рис. 12.14). Она имеет вид прямой,
параллельной оси абсцисс, что соответствует р0 = со и, согласно
уравнениям (12.21) и (12.22), свидетельствует о том, что
скоростьопределяющей стадией является ферментативная реакция. Тот факт,
что график представляет собой прямую, приводит к заключению, что члены,
содержащие j и у2, в правой части уравнения (12.13) незначимы, поэтому
уравнение можно упростить. Действительно, при добавлении продукта реакции
- ацетальдегида - во внешний раствор ток не уменьшается. Следовательно, в
