Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
концентрационной поляризации раствор фермента с внутренней стороны
мембраны является менее насыщенным, чем можно ожидать, исходя из внешней
концентрации sx. Этот эффект описывается выражением в первой скобке,
которое уменьшает значение члена с /скат.
Во-вторых, простой член к' "1 будет определяющим, если процесс
лимитируется кинетикой электродной реакции и почти весь фермент
превращается в Е'. Эти условия выполняются, если электрохимические
процессы протекают медленно и отсутствует ингибирование фермента
продуктом реакции. Константа скорости к' входит в то же выражение в
скобках, что и произведение Т/скат, поскольку в любом случае скорость-
определяющая стадия включает оборот фермента.
В-третьих, два других члена уравнения, включающих к', также относятся к
случаям, в которых лимитирующей является кинетика электродных процессов.
Первый член в скобках описывает ситуацию, когда большая часть фермента
находится в форме ЕС либо Е'Р, а второй-когда фермент присутствует в
основном в виде Е и, следовательно, для его превращения в Е' требуется
субстрат S. Оба этих члена тем больше, чем выше концентрация продукта Р
позади мембраны, что может быть связано либо с высокой внешней
концентрацией рх, либо с медленным переносом через мембрану генерируемого
в реакционной зоне продукта (член j/k'P). Ингибирование процесса
продуктом возникает вследствие того, что при превращении из Е, ES или Е'Р
в Е' и далее в переходное состояние на электроде (скоростьопределяющая
стадия) продукт Р должен высвобождаться. Это не относится к описываемому
простым выражением к' ~1 случаю, когда фермент находится в основном в
форме Е'.
Наконец, рассмотрим последний член в правой части уравнения (12.8). Он
будет доминирующим, если процесс лимитируется стадией транспорта S через
мембрану. При этих условиях поток j не зависит от концентрации фермента;
скорости как ферментативной, так и электродной реакций достаточно высоки,
чтобы субстрат S расходовался сразу после прохождения мембраны.
12.4. Электроды второго поколения
Обратимся теперь к электродам второго поколения. В этих электродах
фермент Е' регенерируется преимущественно путем реакции с медиатором М, а
не прямой реакции на электроде. В некоторых случаях медиатор иммобилизуют
на поверхности электрода. Тогда константа скорости к' в приведенной выше
схеме реакции характеризует просто гетерогенную реакцию фермента с
иммобилизованным медиатором. Следовательно, применим тот же теоретический
подход. В другом варианте медиатор присутствует в растворе электролита.
Тогда в рассматриваемой схеме реакцию с константой скорости к' следует
заменить гомогенной реакцией Е' с М:
Е' + М-"Е + М'.
В большинстве случаев концентрация М достаточно велика, чтобы при
функционировании электрода оставаться практически постоянной.
Следовательно, в уравнении (12.8) мы можем заменить к' на эквивалентную
константу скорости Lk4m, описывающую регенерацию фермента:
L У Н 1,1, K3-X(l +К2-1)Г.. . j
154
Глава 12
Анализ различных членов этого уравнения аналогичен анализу уравнения
(12.8).
Рассматривая электроды второго поколения, следовало бы учесть обратную
реакцию с константой скорости к_4 и электрохимическую регенерацию
медиатора:
к4
Е' + М <5 е + м'
к-4
к'
На электроде: М' -> М.
Однако, рассматривая реакции М', необходимо иметь в виду следующее: для
того, чтобы свободная энергия переходного состояния с константой к' была
выше, чем для состояния с константой к4, должно выполняться условие
к' < Ьк_4 е. (12.12)
Поскольку к' описывает регулируемую электродным потенциалом
электрохимическую реакцию медиатора, молекулы которого невелики, можно
полагать, что к' > 0,1 см х х с-1. При типичных значениях L~ 10"2 см и е
~ 10"4 моль/дм3 неравенство (12.12) выполняется только при значениях к_4,
больших 105 дм3моль"1с"1. Значения к_4 приводятся редко, но они могут
быть рассчитаны из известных значений к4 и разностей стандартных
потенциалов восстановления фермента и медиатора соответственно. Найдено,
что даже если скорость прямой реакции контролируется диффузией (~ 109
дм3моль"1 с"1), при разности значений Е°, превышающей 250 мВ, к . 4
меньше 105 дм3 моль"1 с"1. В действительности значения к4 еще меньше;
кроме того, обычно выбирают медиаторы, достаточно отличающиеся от
фермента по величине Е°, чтобы реакция протекала полностью до конца.
Поэтому мы вряд ли сможем найти пример, где реакционную схему пришлось бы
усложнить. Это позволяет также обойтись без громоздких математических
выражений.
12.5. NADН-электроды
Система NAD+/NADH поистине универсальна - она служит кофактором более 250
ферментов. NADH эффективно окисляется на электродах, изготовленных на
основе проводящих органических солей [2, 21]. Эти данные позволили
приступить к разработке семейства электродов второго поколения, в которых
реакция с участием фермента сопровождается регенерацией NAD+ путем
окисления NADH (гл. 15). В присутствии субстрата SH2 в системе протекают
