Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
157
Хочется подчеркнуть, что при выводе выражений, описывающих кинетику
реакций для ферментных электродов, важно, во-первых, представлять
результат в виде функции величин, обратных константам скоростей реакций,
и, во-вторых, интерпретировать полученные выражения с помощью диаграмм
свободной энергии. Оба подхода мы успешно использовали в работах по
кинетике гомогенных ферментативных реакций [6,
9].
12.6. Отсутствие ингибирования фермента продуктом реакции
Уравнения (12.8), (12.11) и (12.13) слишком сложны для расчета у; с нашей
точки зрения, в данном случае попытки решения уравнений третьей или
четвертой степени почти ничего не дадут для понимания сути процессов.
Маловероятно, однако, что в реальной системе все члены данного уравнения
одинаково значимы. Проведенный выше анализ уравнений позволяет
идентифицировать скоростьопределяющий процесс. В тех случаях, когда
отсутствует ингибирование продуктом, уравнения (12.8), (12.11) и
(12.13) сводятся к одному виду, и, таким образом, наш теоретический
подход применим к широкому кругу ферментных электродов.
Для дальнейшего анализа мы выбрали уравнение (12.8). Начнем с
преобразования его к виду, сходному с уравнением Хэйнеса [18] для анализа
кинетики ферментативных реакций в рамках модели Михаэлиса - Ментен:
^оо _ 1
./ ^МЕ
1+^Mi ]
^MF. V k.'s sa
(12.14)
В это уравнение мы ввели эффективную константу скорости кМЕ
электрохимической реакции в ферментном электроде с низкой концентрацией
субстрата, определяемую выражением
1АмЕ = ^м/(ех^кат) + lAs- (12.15)
Аналогичный параметр мы вводили ранее [4, 5] при описании
модифицированных электродов, и, действительно, Км соответствует случаю
рассмотренных тогда слоистых систем. В зависимости от того, какая реакция
медленнее, Кш, определяется либо кинетикой ферментативного процесса
(член, содержащий Км//скат), либо транспортом субстрата через мембрану
(член с /с'). Еще раз отметим, что выражение (12.15) включает величины,
обратные константам скоростей этих процессов.
В уравнение (12.14) мы ввели также константу КМЕ, эквивалентную константе
Михаэлиса для ферментного электрода. КМЕ определяется выражением
^ ^мС^кат) 1 + ex(k's) 1
к"' <".")-+(*•)-¦ ¦ (1216)
По смыслу Кш аналогична константе Михаэлиса для кинетики гомогенной
ферментативной реакции. При концентрациях меньше КМЕ система является
ненасыщенной. В этом случае ток пропорционален концентрации субстрата и
определяется константой скорости кЫЕ. При концентрации выше KMF система
становится насыщенной и поток / достигает максимального значения/тах,
который можно выразить через константу /скат:
СКат,ЕУ1 = (Lk^y1 + (к'У1 = es/ymax. (12.17)
Поскольку константа k'tai Е описывает поток на единицу площади, она имеет
обычную размерность константы скорости электрохимического процесса (см-
сч). Из уравнения (12.7), также содержащего величины, обратные константам
скоростей реакций, видно, что в зависимости от того, какой член меньше,
наблюдаемое значение /с[аг Е опреде-
158
Глава 12
ляется либо кинетикой ферментативной реакции в стадии насыщения
(константой /ска1), либо электрохимической регенерацией (к').
Из уравнений (12.15)-(12.17) получаем:
^кат,Е/-^МЕ ^Ме/^Х- (12.18)
Это уравнение характеризует ферментный электрод в условиях
ненасыщенности. Оно связывает кинетический параметр (/скат/Км),
используемый этимологами, с константой скорости электрохимической реакции
к'.
Первая стадия анализа заключается в нахождении к'мг по графику
зависимости s.,)j от Как видно из уравнения (12.14), при sx ->0 эта
зависимость имеет предельное значение (sx/j)0 =(/сме)-1- Далее для
значений sjj, значительно больших, чем (sjj)0, рассчитываем значения р,
где
P = 7T^TsSL (12Л9)
(/A Jo
Ю
2,0
5,0
4,0
4,0
У2/?//4
6,0 8,0 Scoj К ME
р-i
3.0
2.0 1,0
6,0 8,0 Soo/KmE
КмеУ
0,5
1,0
1,5
Р
2,0
Рис. 12.4. Типичные зависимости потока от концентрации субстрата для
различных значений k'UE/k's при отсутствии ингибирования фермента
продуктом реакции (а). Из этих зависимостей рассчитаны функции Хэйнеса
(б) и зависимости по уравнению
(12.20)
1-0,00;
(в). Значения к 2-0,5; 3-0,80; 4
me/^s
1,00.
Амперометрические ферментные электроды
159
Подстановка к'МЕ и р в уравнение (12.14) дает
Р_1-1
У =------
_ j _ Р ^МЕ
ЛМЕ -
(12.20)
Уравнение (12.20) предсказывает, что зависимость у от р должна быть
прямолинейной. По отрезку, отсекаемому на оси ординат, находим константу
Михаэлиса для электрода КМЕ, а по отрезку, отсекаемому на оси абсцисс,
р0, можно оценить относительный вклад кинетики ферментативной реакции и
транспорта через мембрану в наблюдаемое значение /смЕ. Из уравнений
(12.15) и (12.20) находим, что
Если значение р0 (отрезок, отсекаемый на оси абсцисс) равно единице, то
скорость-определяющей стадией заведомо является транспорт S через
мембрану. С другой стороны, если получается горизонтальная линия,
соответствующая р0 = со, то лимитирующей является не достигшая предела
скорость ферментативной реакции. Следовательно, график у(р) представляет
