Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
осуществляется ли окисление фермента прямым переносом электрона на
поверхность электрода или же имеет место перенос электрона с помощью
медиатора. В последнем случае фермент реагирует в растворе электролита с
TTF+ или TCNQ-, а затем эти частицы вновь окисляются на электроде. Ценас
и Кулис [14] утверждают, что реакция
Амперометрические ферментные электроды
165
глюкозооксидазы на электроде из NMP+TCNQ" протекает с участием медиатора.
Однако, как показано в работе [7], аргументы этих авторов неубедительны.
С помощью дискового электрода с кольцом мы пытались определить содержание
растворенного NMP+ или TCNQ- вблизи электрода. К нашему удовольствию,
сделать это оказалось невозможно. Отсюда мы сделали вывод, что
концентрации этих ионов должны быть значительно меньше 1 мкмоль/дм3.
Сопоставляя эти концентрации с константами скоростей гомогенных реакций
второго порядка, полученными Ценасом и Кулисом (~ 104дм3 моль-1 с-1),
находим, что гомогенный механизм с участием медиатора никоим образом не
может дать таких высоких значений /с'кат>Е, что приведены в табл. 12.1.
Растворимость солей слишком мала, а скорость гомогенной реакции-низка,
чтобы медиаторный механизм переноса был эффективным.
Интересно было бы обсудить, почему проводящие органические соли являются
такими хорошими электрокатализаторами для флавопротеинов. Мы обнаружили,
что многие из этих ферментов так сильно адсорбируются на поверхности
электрода, что можно изготовить сенсор вообще без мембраны. Достаточно
окунуть электрод в раствор фермента, удалить избыток фермента
промыванием, и электрод готов. Адсорбированный слой держится настолько
прочно, что не переходит с поверхности даже в раствор, в котором
отсутствует фермент. Причиной такого сильного притяжения может быть то,
что в структуре проводящей соли чередуются положительные и отрицательные
ионы. Можно ожидать, что беспорядочно разбросанные по поверхности
положительные и отрицательные заряды сильно взаимодействуют с
соответствующими зарядами на поверхности фермента. Некоторые
исследователи предпочитают объяснять это явление гидрофобным
взаимодействием между ферментом и ароматическими группами на поверхности
электрода. Нами показана [8] важность
Рис. 12.9. Сигнал глюкозного ферментного электрода сразу по изготовлении
и после 28 дней непрерывного использования.
15
30
[ Глюкоза ], ммоль /дм3
166
Глава 12
притяжательного взаимодействия между ферментом и электродом для
каталитического переноса электрона в биохимических реакциях. Именно такое
взаимодействие наблюдается между флавопротеиновыми ферментами и
проводящими солями.
12.10. Стабильность электрода
Стабильность этих электродов также очень высока. Мембранный электрод
может работать непрерывно в течение 28 дней. Результаты длительных
испытаний электрода для определения глюкозы представлены на рис. 12.9.
После месяца работы сенсор потерял всего 20% первоначальной активности.
Кинетический анализ, подобный приведенному выше, показал, что
лимитирующей стадией по-прежнему остается транспорт субстрата через
мембрану, а небольшая потеря активности электрода, по-видимому, связана с
порчей мембраны. Еще раз подчеркнем, как важно знать, что в этом случае
функция электрода определяется свойствами мембраны.
12.11. Другие ферменты
До сих пор наше внимание было сосредоточено на системе с
глюкозооксидазой, но и другие ферменты реагируют с электродами на основе
проводящих органических солей. Из исследованных нами материалов [7] соль
TTF+ TCNQ дает наименьший фоновый ток, поэтому для дальнейшей работы была
выбрана именно она. Этот электродный материал использовали в сочетании с
четырьмя ферментными системами, содержащими флавиновую простетическую
группу, FAD. Во всех случаях восстановленный фермент можно окислять
непосредственно на электроде. Подробные сведения об исследованных
фермент-субстратных системах приведены в табл. 12.2. В каждой
Таблица 12.2. Характеристики фермент-субстратных систем
Фермент Активность. р/мг Субстрат рн Буферный раствор (0,1 М)
Ксантиноксидаза (ЕС 1.2.3.2) 1,25 Ксантин 7,4 Фосфатный
D-Аминокислотная оксидаза 14 D-Аланин 8,0 Трис
(ЕС 1.4.3.3) L-Аминокислотная оксидаза 0,44 Фенилаланин 6,5 Фосфатный
(ЕС 1.4.3.2) Холиноксидаза (ЕС 1.1.3.17) 50 Бетаиновый альдегид
7.4 Фосфатный
такой системе мембранный электрод чувствителен к увеличению концентрации
соответствующего субстрата. На рис! 12.10 представлены типичные
результаты для всех четырех систем. Эти результаты анализировали в
соответствии с описанным выше подходом. На рис. 12.11, а~в показаны
рассчитанные по уравнению (12.20) зависимости у(р) для ксантиноксидазы и
D- и L-аминокислотной оксидазы. Во всех трех случаях получены прямые,
пересекающие ось абсцисс в точке со значением р = + 1. Это показывает,
что скоростьопределяющей стадией является транспорт субстрата через
мембрану. Следовательно, как и в случае глюкозооксидазы, в
рассматриваемых комбинациях трех ферментов с электродом на основе TTF+
