Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
современного оборудования.
464
Г мши 29
29.3.1. Термический ферментный иммуносорбентный анализ
Ферментный термистор можно успешно применять в быстроразвиваклцейся
области иммунохимического анализа-для определения антигенов и антител.
Этот метод авторы предложили назвать "термическим ферментным
иммуносорбентным анализом" (ТФИСА) [26]. Колонку ферментного термистора
заполняют иммуносорбентом, например Сефарозой CL-4B с иммобилизованными
антителами. При определении антигена в проточную систему вводят антиген,
меченный ферментом (например, каталазой). Количество удерживаемого в
колонке меченного каталазой фермента зависит от содержания антигена. Чем
меньше его в пробе, тем больше меченого антигена будет обнаружено в
колонке и, следовательно, тем больше тепла выделится при последующем
вводе в поток пероксида водорода, субстрата каталазы. В настоящее время
чувствительность метода ТФИСА достигает 10"13 М. После анализа
иммуносорбент нетрудно регенерировать промыванием глицином при низких pH;
полный цикл измерения занимает всего 10-15 мин. Преимущество метода
состоит в том, что с его помощью можно быстро и просто анализировать
единичные разнородные пробы. Для использования в биотехнологии, например
для контроля производства гормонов и белков микроорганизмами,
трансформированными методами генной инженерии, удобен разработанный
авторами [1] автоматизированный вариант ТФИСА. В этом варианте клапаны,
регулирующие потоки анализируемого раствора, раствора субстрата и
промывочных растворов, управляются программируемым контроллером.
Продолжительность цикла составляет 5 мин; пробы можно отбирать из
технологических потоков или перемещать отобранные пробы к прибору с
помощью транспортера.
29.3.2. Применение в клинической медицине
Описано несколько рутинных методов определения мочевины в сыворотке крови
при помощи иммобилизованной уреазы [2, 9, 14, 37, 42]. Диапазон
линейности этих методов весьма широк-от 0,01 до 200 ммоль/л [9].
Поскольку пробы сыворотки обычно разбавляли в 10 раз, концентрации в
основном попадали в интервал 0,3-10 ммоль/л. В результате имелся
значительный запас активности фермента, поэтому можно было ожидать, что
стабильность работы системы будет высокой. Колонку с ферментом можно
использовать несколько месяцев или для анализа нескольких сотен проб
сывороток. На проведение одного анализа требуется всего 2-3 мин, что
вполне приемлемо для небольшой серии проб. Точность измерений также
вполне удовлетворительна (относительное стандартное отклонение ~1%).
Для определения глюкозы применяют либо гексокиназу, либо глюкозооксидазу
с каталазой. Растворимую гексокиназу использовали в энтальпиметрическом
методе с прямым вводом проб для определения глюкозы в диапазоне 0,5-50
ммоль/л [29]. Применение аналогичной системы с иммобилизованной
гексокиназой давало возможность определять концентрации глюкозы в
диапазоне 0,5-25 ммоль/л [2]. Учитывая высокую производительность (40
проб/час), точность, а также долговременную стабильность и
воспроизводимость, рассматриваемую систему можно считать в высокой
степени приемлемой в качестве рутинного инструмента для клинического
определения глюкозы.
Вместо гексокиназы удобнее использовать глюкозооксидазу, так как
последняя более стабильна и не нуждается в кофакторе [8]. Недостатком
данной системы является, однако, то, что отклик линеен лишь до 0,45
ммоль/л, а при соиммобилизации глюкозооксидазы и каталазы-до 0,7 ммоль/л.
Этот недостаток можно преодолеть, разбавляя пробы в 50-100 раз или вводя
малые объемы сыворотки (5-20 мкл) прямо в поток буферного раствора,
входящий в ферментный термистор. В результате дости-
Теория и практика калориметрических сенсоров
465
гается достаточно высокая точность-в течение дня относительное
стандартное отклонение составляло 0,6% как для одноколоночного, так и для
двухколоночного прибора. Концентрации глюкозы, найденные при помощи
ферментного термистора, хорошо согласуются с величинами, полученными
обычным спектрофотометрическим ферментным методом, используемым в
медицинской диагностике. Стабильность работы описанной системы была по
крайней мере не хуже, чем у уреазного термистора. Аналогичные результаты
получены в работе [41], где также использовали соиммо-билизованные
глюкозооксидазу и каталазу, а также в работе [22], где оба фермента
иммобилизовали на волокне, что привело к расширению линейного диапазона,
правда, за счет некоторого снижения чувствительности и, возможно,
стабильности работы прибора.
Используя вместо кислорода другой акцептор электронов, бензохинон, можно
значительно расширить диапазон линейности отклика глюкозооксидазной
системы. Введение 45 ммоль/л бензохинона в рабочий буферный раствор
приводит к расширению этого диапазона от 0,1 до 70 ммоль/л [20].
Глюкозооксидаза/каталазный термистор в комбинации с ферментом,
расщепляющим дисахариды, можно использовать для определения
глюкозосодержащих дисахаридов (например, целлобиозы [12] и лактозы [24]).
