Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
в держатель колонки и связывает трубку с проточной системой. Найлоновая
трубка удобна для анализа неочищенных проб, содержащих твердые частицы
[27], но имеет низкую ферментную емкость. Обычно в качестве носителя
используют пористое стекло с контролируемым размером пор, которое не
только обладает высокой ферментной емкостью, хорошей механической
прочностью, химической и микробной устойчивостью, но и позволяет
применять сравнительно простые методики иммобилизации фермента. В ряде
работ [7, 31] применяли и другие материалы. Разные носители существенно
различаются по способности к адсорбции компонентов анализируемых
растворов, что зависит, например, от реального распределения на их
поверхностях ионных и гидрофобных групп. Поскольку такая адсорбция почти
наверняка вызывает неспецифическое выделение тепла и даже может влиять на
ферментативную реакцию, выбор материала носителя весьма существен.
Хорошие результаты получаются при использовании пористого стекла с
размерами пор от 500 до 2000 А и частиц-около 80 меш. Если используют
необработанное или обработанное алкилпропиламином пористое стекло,
полученное из разных источников, активация стекла глутаровым альдегидом с
последующей иммобилизацией фермента почти всегда дает хорошие результаты.
Следует отметить, что обычно в колонку термистора вводят довольно большой
избыток фермента (нередко 100 ед. активности). Эта процедура обеспечивает
стабильность работы и неизменность характеристик системы при большом
числе проб и в случае длительных
Теория и практика калориметрических сенсоров
461
непрерывных измерений. Колонка должна нормально функционировать в течение
нескольких месяцев.
29.2.3. Методика анализа
Оборудование для ферментного термисторного анализа может включать
неактивную колонку сравнения для компенсации неспецифического выделения
тепла. Такая система с разделением потока [25] эффективна при анализе
неочищенных проб (например, при определении триглицеридов [31]), но во
многих случаях неспецифические эффекты можно исключить тщательным
планированием методики анализа, предотвращая колебания состава
растворителя (т. е. стабилизируя теплоты смешения и растворения) и
адсорбцию макромолекул и микроорганизмов.
Буферный раствор непрерывно прокачивают через каждый рабочий канал со
скоростью 0,5-3,0 мл/мин. Обычно пробы вводят короткими импульсами через
хроматографический клапан с петлей объемом от 0,1 до 1 мл. При коротких
импульсах термически стационарное состояние не достигается, но
ферментативная реакция дает температурный пик, высоту которого обычно и
принимают за меру концентрации субстрата [7].
Если нет ограничений по концентрации реагентов (активность оксидазы,
например, определяется подачей кислорода) или по каким-либо другим
факторам, то линейная зависимость высоты пика от концентрации субстрата
наблюдается в диапазоне от 10"5 до 10"1 М. Максимальное число проб
фиксированного объема, которое может быть проанализировано данной
системой, составляет от 15 до 60 проб в час. Последнее значение получено
при анализе проб малого (до 0,1 мл) объема с повышенной (до 2-3 мл/мин)
скоростью течения. Для упрощения дозировки проб использовали
модифицированный пробоотборник Auto Analyzer (фирма Technicon Instruments
Corp., Территаун, Нью-Йорк, США), соединенный через интерфейс с небольшим
настольным компьютером, который также контролирует дозировочный клапан.
Такая система может работать без присмотра, например, всю ночь. Если
набор проб включает стандарты для градуировки, то компьютер программируют
на расчет концентрации каждой пробы по высоте или площади пика. С
увеличением длительности импульсного вывода пробы более 1-5 мин
температурный сигнал постепенно достигает постоянного значения,
пропорционального концентрации. Следовательно, концентрацию субстрата
можно регистрировать непрерывно.
29.2.4. Усиление теплового сигнала
Для усиления выделения тепла имеются различные приемы. Молярная энтальпия
многих ферментативных реакций достаточно высока, и поэтому можно
использовать такой прибор, как ферментный термистор с чувствительностью к
субстрату порядка 10"5 М. Однако в некоторых реакциях, например при
ферментативном гидролизе эфиров, тепла выделяется очень мало, а при
гидролизе ацетилхолина, катализируемом холинэстеразой, изменение
энтальпии вообще близко к нулю. Тем не менее такие реакции можно
детектировать калориметрически. Дело в том, что на стадии гидролиза
выделяется протон, который может протонировать компоненты буферного
раствора с высокой энтальпией (например, для Трис-буфера АН = -47,5
кДж/моль [30]), и процесс в целом становится экзотермическим. В работе
[30] ферментный термистор с иммобилизованным трипсином использовали как в
Трис-, так и в фосфатном буферном растворе (АН = - 4,7 кДж/моль).
Чувствительность можно повысить также соиммобилизацией последовательно
действующих ферментов. Каждая ступень реакции вносит вклад в
регистрируемый
