Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
растворе и не улавливалась термистором. По этой причине чувствительность
была низкой, и даже если этот недостаток был до некоторой степени
преодолен в более поздних конструкциях [37, 42], термические ферментные
датчики предназначались главным образом для серийных анализов.
Существенно большая эффективность определения теплоты реакции достигнута
в системах, в которых использовали небольшие колонки с ферментом,
иммобилизованным на частицах носителя. К таким системам относятся
"ферментный термистор" [30, 32] и проточный энтальпиметрический
анализатор с иммобилизованным ферментом [3]. Описана также комбинация
серийного энтальпиметра с термостатируе-мой колонкой, содержащей
иммобилизованный фермент [20]. В этих системах тепло переносится
жидкостью, проходящей через колонку мимо термодатчика, вмонтированного в
верхнюю часть колонки или на ее выходе.
При использовании проточных устройств дополнительным преимуществом
является возможность непрерывного анализа. Большинство подобных приборов
имеет довольно близкие характеристики. Как установлено по реакциям с
известной энтальпией (табл. 29.1) или с помощью электрической калибровки
[6], 80% тепла, выделяющегося в таких "полуадиабатических" приборах,
можно обнаружить в виде изменения температуры. При концентрации данного
субстрата 1 мМ и изменении энтальпии на 80 кДж/моль можно ожидать, что
высота пика будет соответствовать не менее 0,01 С. Тогда, чтобы
обеспечить точность 1%, требуется чувствительность по температуре порядка
0,0001°С. Как уже отмечалось, большинство ферментативных реакций
сопровождается значительным выделением тепла (в интервале 25-100
кДж/моль), поэтому измерение концентраций порядка 0,1 мМ не должно
представлять особых трудностей.
29.2. Оборудование и методика эксперимента
29.2.1. Аппаратура
В работе [7] был впервые описан разработанный авторами ферментный
термистор. Схема последнего варианта этого прибора приведена на рис.
29.1. На рис. 29.2 показано все необходимое для ферментного термоанализа
оборудование. В алюминиевом цилиндре с контролируемой температурой (25;
30 или 37°С), помещенном в изолирующую рубашку из полиуретана, находится
другой алюминиевый цилиндр, отделенный от первого тонкой прослойкой
воздуха, до некоторой степени обеспечивающей термическую изоляцию. Тепло
передается между двумя блоками в основном путем конвекции жидкости,
перекачиваемой из главного теплообменника во внешнем цилиндре в короткий
вспомогательный теплообменник во внутреннем цилиндре. Таким образом,
колонки окружены средой с в высокой степени постоянной температурой.
Большая часть тепла, выделяющегося в колонке с ферментом, уносится
потоком жидкости. Температуру на выходе колонки измеряют небольшим
термистором, смон-
Теория и практика калориметрических сенсоров
459
Мостика-
Рис. 29.1. Поперечное сечение ферментного термистора в термостатируемой
алюминиевой рубашке. 1 -полиуретановая изоляция; 2-вводы плексигласовой
трубки и термисторчого датчика; 3-термостатируемый алюминиевый цилиндр;
4-теплообменник; 5-колонка с ферментом; 6- термистор, прикрепленный к
капиллярной золотой трубке; 7-выход колонки. В корпусе имеются два
одинаковых отверстия для ввода колонок, одно из которых можно
использовать как канал сравнения (в системе с разделением потока).
тированным в короткой капиллярной трубке из золота. Обычно используют
двухшариковый термистор (А395, фирма Victory Engineering Corp.,
Спрингфилд, Нью-Джерси, США) с сопротивлением 16 кОм при 25°С и
температурным коэффициентом - 3,95%/град. Кроме того, во внутренний блок
вмонтирован эталонный термистор для дифференциальных измерений, что
повышает стабильность нулевой линии.
Температуру регистрируют при помощи мостика постоянного тока Уинстона со
стабилизированным усилителем и прецизионными проволочными резисторами с
низким температурным коэффициентом. При максимальной чувствительности
моста изменение сигнала самописца составляет 100 мВ при изменении
температуры на 0,001°С. На практике предельная чувствительность системы
обычно ниже (порядка 0,01°С). Она определяется главным образом
флуктуациями температуры, вызываемыми трением и турбулентностью потока в
колонке. Отметим, что во многих реакциях изменению концентрации субстрата
от 0,5 до 1 мМ соответствует изменение температуры на 0,01 °С. За
последние 5 лет в нашем институте изготовлено более 15 приборов,
аналогичных изображенным на рис. 29.2. Эти приборы используют в различных
лабораториях.
460
r.iaea 29
Рис. 29.2. Ферментный термистор с ручным управлением.
29.2.2. Колонка с ферментом
Смена колонок осуществляется очень легко: колонку просто вставляют в
нижний конец пластиковой трубки, служащей для установки колонки в прибор
и содержащей выходной патрубок и термодатчик. Можно использовать колонки
различного диаметра (максимальный внутренний диаметр 7 мм) и высоты
ферментного слоя (максимум 30 мм). Носителем фермента может служить
найлоновая трубка, намотанная на специальный адаптер, который вставляется
