Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
одновременно возвращает половину израсходованного кислорода; в результате
выделение тепла возрастает вдвое. Оба метода имеют одинаковую
чувствительность при определении кислорода в крови. Термисторный датчик
позволяет определять до 0,2 ммоль/л этанола (при линейности сигнала до 2
ммоль/л) с погрешностью 1,5%. Помимо этанола, оба метода дают хорошие
результаты при определении метанола, пропанола и бутанола.
29.3.3. Определение активности фермента
При незначительной модификации проточной системы ферментный термистор
можно использовать для определения активности растворенного фермента.
Исследуемый раствор фермента и раствор соответствующего субстрата (в
относительном избытке) пропускают порознь через теплообменник; затем их
смешивают, быстро пропускают через один из коротких внутренних
теплообменников для устранения тепла, выделяемого при смешении растворов,
и направляют в реакционную камеру (объемом ~ 1 мл). Последняя
устанавливается вместо обычной ферментной колонки и представляет собой
либо неактивную колонку, либо тефлоновую трубку, образующую "реакционную
спираль". Температуру на выходе реакционной камеры непрерывно измеряют
одним из термисторных датчиков, как описано в разделе 29.2. Для большого
числа разных ферментов обнаружена линейная корреляция между температурным
откликом и активностью фермента [6]. Чувствительность метода-0,01-0,1 ед.
активности/мл в зависимости от типа фермента. Калориметрическое
определение активности растворенных ферментов может представить интерес
для клинического анализа, а также для контроля процессов очистки
ферментов. Хотя абсолютная чувствительность этого метода невелика, он
имеет свои достоинства, так как позволяет проводить прямые непрерывные
измерения в потоке. Его можно применять для анализа неочищенных проб,
расходуя недорогие субстраты (здесь нет необходимости в дорогостоящих
субстратах, дающих окрашенные продукты).
29.3.4. Калориметрический контроль в хроматографии
Ферментный термистор успешно применяют в качестве инструмента
специфического контроля в гель-фильтрации, ионообменной и аффинной
хроматографии [11]. Поскольку ферментный термистор можно использовать для
непрерывного определения активности ферментов непосредственно в
неочищенных пробах, с его помощью можно идентифицировать и локализовать
отдельные компоненты сложной хроматограммы, например на начальных стадиях
процесса очистки фермента (рис. 29.4). Кроме того, в аффинной
хроматографии при элюировании ферментам часто сопутствуют их коферменты,
сильно поглощающие в УФ-области, что затрудняет непрерывный контроль за
содержанием фермента по УФ-спектрам или спектрофотометрически
регистрируемым изменениям концентрации NAD(P)H. Таким образом, в аффинной
хроматографии калориметрическое определение активности элюированного
фермента имеет определенные преимущества.
29.3.5. Контроль технологических и ферментационных процессов
Одна из наиболее перспективных областей применения термических
биоанализаторов-контроль технологических и ферментационных процессов.
Можно ожидать, что по мере развития биотехнологии интерес к прямым
методам непрерывного опре-
30'
о 12 3 4 5
Время, v
Рис. 29.4. Гель-фильтрация 1 мл неочищенного экстракта дрожжей па колонке
с ультрагелем Ас А 44; элюент-0,2 М раствор Трис ¦ НС1 + 0,0133 М MgCl2,
pH 7,8; скорость потока 0,75 мл/мин. Для анализа на ферментном термисторе
с гексокиназой (пунктирная линия) выходящий из колонки поток смешивали с
раствором субстрата, содержащим 0,54 М глюкозы и 0,011 М АТР, скорость
потока составляла 0,2 мл/мин [11]. (Приведено с разрешения издательства
Academic Press, Орландо, Флорида, США.)
деления специфических компонентов, образующихся или расходуемых в ходе
какого-либо процесса, будет возрастать. За исключением методов
определения физических переменных, таких как pH, р02 и рС02, в
большинстве аналитических методов, используемых в настоящее время,
контроль за протеканием процесса осуществляется дискретно и автономно.
Технологи, однако, предпочитают непрерывные методы контроля,
осуществляемые на линии. Такие методы не только более информативны, но
позволяют снизить расходы на отбор проб и содержание персонала. Опыт,
полученный в этой области, используется и в медицине, например при
мониторинге in vivo. Возможности применения ферментных термисторов для
непрерывных измерений и контроля исследовали в ряде работ. Так, в работе
[6] с помощью ферментного термистора контролировали состав жидкости на
выходе ферментного реактора, содержащего (3-галактозидазу. Лактоза
молочной сыворотки, прокачиваемой
I_______________I________________|----------------1-------- -..-I-----
0,5 1,0 7,5 2,0
Время, У
Рис. 29.5. Изменение во времени концентрации глюкозы, измеряемой
термистором па основе
системы глюкозооксидаза/катализа (-), и скорости прокачки сыворотки,
содержащей 150 мМ
лактозы, через проточный реактор с лактазой, иммобилизованной на сефарозе
