Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
462
Глава 29
температурный сигнал, так что последний определяется суммой энтальпий
всех реакций. Например, чувствительность определения глюкозы с
глюкозооксидазой по реакции
глюкозооксидаза г , и
Глюкоза + О 2 >глюконо-о-лактон + Н20
можно повысить вдвое, введя в колонку ферментного термистора каталазу:
Н202ка^яа^ 1/202 + Н20.
В последней реакции регенерируется половина кислорода, потребляемого в
реакции с глюкозооксидазой, и за счет этого верхняя граница диапазона
определяемых концентраций повышается от 0,45 до 0,7 мМ. Преимуществами
соиммобилизованных последовательно действующих ферментов являются также
более быстрое превращение субстрата по сравнению с ситуацией, когда
фермент иммобилизован на отдельных полимерных шариках, а также большая
эффективность при низкой концентрации субстрата.
Если первая реакция слабо экзотермична, соответствующий ей фермент можно
помещать в предколонку, находящуюся снаружи ферментного термистора,
оставив внутри калориметра только фермент(ы), катализирующие последующие
реакции. Это позволяет увеличить гибкость системы и повышает ее суммарную
производительность, поскольку можно использовать более эффективные
колонки с ферментами, особенно на первой стадии. Таким способом с помощью
(3-глюкозооксидазы определяли цел-лобиозу [12], а с помощью (3-
галактозидазы - лактозу [24]. Поскольку энтальпия гидролиза очень мала,
для термических измерений использовали образующуюся при гидролизе
глюкозу, окисляя последнюю в ферментном термисторе с глюкозооксида-
за/каталазной колонкой.
Чувствительность калориметрического метода можно существенно повысить
рециклированием субстрата, например, если оксидаза и дегидрогеназа
действуют на одну и ту же пару субстрат/продукт. Недавно показано, что,
используя лактатоксидазу и каталазу, соиммобилизованные с
лактатдегидрогеназой, чувствительность определения лактата или пирувата
можно повысить в 1000 раз [40]. Проходя через колонку, лактат многократно
окисляется лактатоксидазой, а пируват восстанавливается
лактатдегидрогеназой до лактата, расходуя при этом NADH. Полное изменение
энтальпии здесь примерно то же, что и при окислении NADH кислородом,
которое представляет собой сильно экзотермическую реакцию (см. табл.
29.1). На колонке объемом 0,8 мл при объеме пробы 0,5 мл и скорости
потока 1 мл/мин этим методом можно определять лактат и пируват в
концентрации до 10 нМ. В системе с соиммобилизованной парой
лактатдегидрогеназа/глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа за счет рециклирования
чувствительность к NADH можно увеличить в 80 раз.
29.3. Практические приложения
Ферментные термисторы и аналогичные им устройства успешно используют во
многих областях биоанализа, например в клиническом анализе, контроле
технологических, в том числе ферментационных процессов, контроле
загрязнения окружающей среды. Недавно показана возможность их применения
при хроматографическом определении ферментов в сложных смесях. Кроме
того, на основе ферментного термистора разработана проточная система для
иммуноанализа. В табл. 29.2 охарактеризовано большое число анализов,
выполненных с помощью ферментных калориметров. Правда, следует иметь в
виду, что некоторые из цитируемых здесь работ
Теория и практика калориметрических сенсоров
463
Таблица 29.2. Определение веществ при помощи ферментных термисторов
Вещество Иммобилизованный биокатализатор Диапазон определяемых
концентраций, ммоль/л Литература
Аскорбиновая кислота Клинический анализ Аскорбатоксидаза 0,05 0,6
[24]
АТР Апираза 1-8 [30]
Холестерин Холестериноксидаза 0,03-0,15 [7]
Эфиры холестерина Холесгериноксидаза + 0,03-0,15 [7]
Креатинин холестеринэстераза Креатининиминогидролаза 0,01-10 [7]
Глюкоза Глюкозооксидаза + каталаза 0,002-0,8 [8, 20, 22, 41]
Глюкоза Г ексокиназа 0,5-25 [2]
Лактат Лактат-2-монооксигеназа 0,005-2 [7]
Щавелевая кислота Оксалатоксидаза 0,005 0,5 [44]
Щавелевая кислота Оксалат декарбоксилаза 0,1-3 [7]
Триглицериды Липопротеинлипаза 0,1-5 [38]
Мочевина Уреаза 0,01 - 500 [2, 9, 14, 37, 42]
Мочевая кислота Уриказа 0,05-4 [7]
Мочевина Определение растворимых ферментов Уреаза (растворимая) 0,1 100
ед./мл [6]
н2о2 Каталаза (растворимая) 0,1-100 ед./мл [6]
Глюкоза + АТР Гексокиназа (растворимая) 0,1 - 2,5 ед./мл [12]
Альбумин (антиген) Иммунологический анализ ( ТФИСА ) Иммобилизованные
антите- 10"10 [26]
Гентамицин (антиген) ла + меченный ферментом антиген То же >0,1 мкг/мл
[7]
Инсулин (антиген) " 0,1 -1,0 ед./мл; [1]
Целлобиоза 0,1-50 мкг/мл Контроль ферментационных процессов (З-
Глюкозидаза + глюкозо- 0,05-5 [И]
Цефалоспорин оксидаза + каталаза Цефалоспориназа 0,005-10 [7]
Этанол Алкогольоксидаза 0,01-1 [18]
Г алактоза Г алактозооксидаза 0,01-1 [24]
Лактоза Лактаза и глюкозооксида- 0,05-10 [24]
Пенициллин за + каталаза Пенициллиназа 0,05-500 [13, 27]
Сахароза Инвертаза 0,05-100 [24]
выполнены довольно давно, так что указанные в них диапазоны определяемых
содержаний могли бы быть значительно расширены при использовании
