Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
мешающую ферментативную активность, и подавив ее подходящим ингибитором.
Этот способ применим и при разработке других мембранных тканевых
электродов.
3.3. Биосенсор АМР
Тканевые материалы не только удлиняют срок службы биосенсора, но и
обеспечивают большую концентрацию заданного биокатализатора. Примером
может служить рассматриваемый в этом разделе биосенсор АМР с
газоаммиачным датчиком. Ограниченная площадь поверхности датчика не
позволяет иммобилизовать большие количества ферментного препарата.
Поэтому если специфическая активность последнего невысока, то и
аналитические характеристики сенсора будут неудовлетворительными. Эффект
низкой концентрации фермента проявился, в частности, в случае ферментного
AMP-электрода, описанного в работе [35]. Используемый в этом сенсоре
выделенный фермент обычно имеет низкую активность, что приводит к малой
величине наклона градуировочных кривых и короткому сроку службы.
Чувствительность и срок службы сенсора АМР можно значительно улучшить при
помощи тонкого слоя мышечной ткани кролика. Повышение чувствительности
биосенсора непосредственно связано с пятикратным увеличением активности
биокатализатора на поверхности датчика.
И в ферментном, и в тканевом АМР-биосенсорах используют протекающую на
поверхности газоаммиачного датчика каталитическую реакцию
АМР + Н20 IMP + NH3.
10
Рис. 3.8. Влияние толщины ткани на время отклика биосенсора АМР.
Концентрацию субстрата меняли в пределах от 0,14 до 0,34 мМ (О) и от 3,0
до 6,6 мМ (П)-
0,2 0Л 0,6 0,8 10,0
Толщина., мм
44
Глава 3
Выделенный фермент иммобилизуют на поверхности датчика с помощью диаце-
тилцеллюлозной мембраны. В тканевом биосенсоре тонкий слой мышечной ткани
кролика удерживают на датчике найлоновой сеткой с отверстиями размером 37
мкм. Сенсоры обоих типов хранят при комнатной температуре в рабочем
буферном растворе, содержащем 0,1 М Трис НС1, 0,1 М КС1 и 0,02% азида
натрия (pH 7,5). После сборки тканевый биосенсор следует выдерживать от 2
до 4 ч для удаления фонового аммиака.
Чтобы улучшить аналитический сигнал тканевого AMP-сенсора, оптимизировали
различные параметры эксперимента (pH, концентрацию ионов калия,
температуру и толщину слоя ткани). Найденные оптимальные условия-рН 7,5,
0,1 М К+ и 25°С. На рис. 3.8 представлены результаты изучения влияния
толщины ткани на время отклика биосенсора. Увеличение толщины ткани
приводит к большим временам отклика, которые становятся неприемлемыми при
толщине слоя больше 0,81 мм. С другой стороны, кусочки ткани толщиной
меньше 0,5 мм неудобны в обращении и плохо воспроизводимы. По этим
причинам для изготовления сенсора используют слои ткани толщиной от 0,5
до 0,8 мм, которые можно легко получить с помощью острого лезвия бритвы.
Слой мышечной ткани кролика толщиной 0,5 мм содержит приблизительно пять
международных единиц АМР-деаминазной активности [10]. В то же время
сравнимый объем (25 мкм) коммерческого препарата фермента имеет
активность всего 0,1 ед. Такая низкая активность и приводит к плохой
чувствительности ферментных биосенсоров. Фактически перед иммобилизацией
выделенный фермент приходится концентрировать фильтрацией в течение 16 ч
и в результате активность ферментного слоя на поверхности электрода
повышается до 0,9 ед. [35]. Но даже после такого концентрирования
ферментативная активность в слое ткани остается выше примерно в пять раз.
В табл. 3.4 приведены основные характеристики сенсоров АМР на основе
различных биокаталитических материалов. Наилучшие эксплуатационные
характеристики, в том числе наклон 58 мВ/рС и срок службы не менее 28
дней, достигаются при использовании кусочка ткани, который обладает
наибольшей ферментативной активностью из всех приведенных материалов.
Напротив, система на основе фермента характеризуется наклоном,
составляющим только 46 мВ/рС и всего лишь четырехдневным сроком службы.
Таким образом, если выделенные ферменты имеют недостаточную специфическую
активность, то более эффективны слои ткани.
Часто бывает трудно найти надежный источник приобретения некоторых видов
млекопитающих для получения специфического тканевого материала. В таких
случаях в качестве биокатализатора удобнее использовать порошок из
высушенной ацетоном ткани. Первая попытка такого рода описана в сообщении
о биосенсоре АМР, в котором пасту из растертой в порошок обезвоженной
ацетоном мышцы кролика физически закрепляли на поверхности аммиачного
датчика [4].
Пасту из растертой в порошок мышцы кролика получают следующим образом. В
пластиковую пробирку (1 мл) вводят 300 мкл буферного раствора,
содержащего 0,1 М Трис-НС1, 0,1 М КС1 и 0,02% азида натрия (pH 7,9), и
добавляют 100 мг замороженного порошка. Смесь перемешивают на вихревой
мешалке в течение 30 с. При такой обработке получается однородная паста,
необходимое количество которой (обычно 10 мг) наносят на тефлоновую
мембрану аммиачного датчика. Поверх пасты помещают диацетилцеллюлозную
мембрану и завинчивают колпачок электрода до положения, при котором паста
