Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
буферном растворе с pH 7,0 при 25 °С.
Градуировочный график линеен в диапазоне от 0,1 до 0,4 мМ тирозина;
возможно также использование части кривой до концентрации 0,9 мМ. Сенсор
работает стабильно не менее восьми дней, а его время отклика составляет
несколько минут. Селективность сенсора к тирозину ухудшается в
присутствии таких веществ, как дигидрокси-фенилаланин, 2,4-дихлорфенол и
л-хлорфснол, которые сами по себе вызывают значительный отклик сенсора.
3.12. Цистеиновый биосенсор
Для конструирования биосенсоров можно эффективно использовать и другие
виды растительных материалов. Например, для определения цистеина на
поверхности аммонийного датчика иммобилизуют модифицированные листья
огурца. Вообще листья растений, по-видимому, имеют много преимуществ как
биокатализаторы благодаря своему строению. Многие листья имеют
многослойную структуру, включающую восковое покрытие (кутикулу) с внешней
стороны листа, слой эпидермальных клеток (эпидермис) и примыкающий к нему
губчатый промежуточный слой; те же слои повторяются в обратном порядке на
другой стороне листа. Кутикула обладает гидрофобными свойствами, однако
проницаема для газов. Газообмен осуществляется через небольшие отверстия
на поверхности листа, называемые устьицами. Губчатый промежуточный слой
наиболее активен в метаболических процессах с участием газов. Для
получения биокаталитических мембранных электродов срезают кутикулу с
наружной или нижней стороны листа и помещают оставшуюся часть листа на
газочувствительный потенциометрический электрод так, чтобы открытый
эпидермальный слой находился в контакте с анализируемым раствором, а
газопроницаемая восковая кутикула-с внутренними элементами сенсора.
Этот принцип был продемонстрирован, в частности, при разработке L-
цистеиново-го биосенсора с использованием огуречных листьев и аммиачного
датчика [45]. В листьях огурца содержится фермент L-
цистеиндесульфгидролаза, катализирующий реакцию
L-Цисгеин + Н20 -> пируват + H2S + NH3.
Таким образом, в цистеиновых сенсорах можно использовать электроды,
чувствительные либо к NH3, либо к H2S, хотя из химических соображений
первые предпочтительнее.
Методика изготовления цистеинового биосенсора довольно проста. Огурцы
(Cucumis saturis) выращивают из семени в почве для рассады. По мере
необходимости отрывают зрелые листья и вымачивают их в воде в течение 45
мин. При вымачивании кутикула размягчается и легко удаляется, обнажая
биохимически активный эпидермис. Эта процедура необходима, так как
субстрат, L-цистеин, с трудом диффундирует через восковый слой кутикулы.
Затем из листа вырезают диск нужного размера, помещают его на торец
газового датчика и закрепляют диализной мембраной.
В фосфатном буферном растворе с pH 7,6 электродная функция такого
биосенсора характеризуется наклоном около 35 мВ/рС в диапазоне от 10"3 до
10'5 М. Такой относительно низкий наклон градуировочной кривой, наряду с
довольно большим временем отклика, свидетельствует о необходимости
дальнейшего совершенствования этого биосенсора. Однако благодаря большому
сроку службы сенсоров (до четырех недель) и исключительно низкой
стоимости листья и их фрагменты как биокатали-
Биосенсоры на основе растительных и живых тканей
53
заторы вполне могли бы конкурировать с иммобилизованными ферментами или
клетками.
I
3.13. Митохондриальный биосенсор
Наряду с цельными фрагментами тканей млекопитающих в биосенсорах можно
эффективно использовать фракции тканевых клеток, иммобилизуя именно те
субклеточные компоненты, которые обладают наибольшей биокаталитической
активностью. Такой подход может быть весьма плодотворным, если необходимо
увеличить количество иммобилизованного фермента или улучшить
избирательность сенсора, устраняя мешающие ферменты, которые содержатся в
других частях клетки. Показано, что некоторые субклеточные фракции можно
использовать как аналитические реагенты. Так. для определения тироксина
можно использовать микросомы печени крысы [34]. Первой удачной попыткой
создания биосенсора на основе субклеточной фракции был биосенсор для
определения глутамина [8]. В этом сенсоре митохондриальную фракцию клеток
кортекса почки свиньи иммобилизовали на газоаммиачном датчике.
Митохондрии содержат два изофермёнта глутаминазы [15], активность которых
и используют в глутаминовом биосенсоре.
Митохондриальную фракцию клеток почки свиньи выделяют по стандартной
методике, включающей дифференциальное центрифугирование [26]. Полученную
митохондриальную фракцию иммобилизуют с помощью обычной
диацетилцеллюлозной диализной мембраны. Собранные биосенсоры помещают в
буферный раствор (0,120 М хлорида калия, 0,02 М Трис-хлорида, 0,04 М
Трис-фосфата, 0,005 М сукцината, 1 мкг/1,5 мл ротенона, 0,02% азида
натрия) с pH 8,5. Сенсоры хранят и используют при комнатной температуре.
Аналитические характеристики митохондриального электрода сравнимы с
характеристиками тканевых и бактериальных электродов и намного
