Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
Исходя из сообщений о наличии АМР-деаминазы [17] и щелочной фосфатазы
[14] в клетках слизистой оболочки тонкого кишечника мыши, можно
предложить три
-lg Г субстрат (М)
Рис. 3.5. Начальный сигнал биосепсора на основе ткани слизистой оболочки
тонкого кишечника мыши. О-аденозин; [J-AMP; A-ADP; ф-АТР.
Биосенсоры на основе растительных и живых тканей
41
возможные схемы деаминирования нуклеотидов.
Неспецифическое
Схема I: А(Х)Р + Н2Р ... ~""Р°вание > I (X) Р + NH3
АМР-деаминаза
Схема И: АМР + Н20----------------------->1МР + NH3
Схема III: АМР + Н,0
Щелочная фосфатаза
аденозин + фосфат
Аденозиндиаминаза
Аденозин-----------------> инозин + NH3
Схема I описывает случай, когда в системе имеется неспецифический
фермент, катализирующий деаминирование всех трех нуклеотидов,-AMP, ADP и
АТР. В схеме II каждому из этих субстратов соответствует свой
специфический деаминирующий фермент. Наконец, схема III объединяет
реакции, катализируемые щелочной фосфата-зой и аденозиндеаминазой: первый
фермент превращает аденозинсодержащие нуклеотиды в аденозин, который
затем деаминируется вторым ферментом, что и создает помехи определению.
Анализируя действие различных активаторов и ингибиторов на мешающую
ферментативную реакцию, можно попытаться выяснить, описывает ли какая-
либо из приведенных выше схем эту реакцию, и какая именно. Согласно
литературным данным, фосфат-ионы ингибируют ферментативную активность как
щелочной фосфа-тазы [19], так и АМР-деаминазы [40]. Известно также, что
глицерофосфат ингибирует АМР-деаминазу [41], но не щелочную фосфатазу
[31]. В последнем случае субстратная специфичность такова, что при
высоких концентрациях глицерофосфата действие щелочной фосфатазы на АМР
пренебрежимо мало. Рис. 3.6 иллюстрирует влияние фосфата и глицерофосфата
на деаминирование АМР и аденозина в тканевом адено-зиновом электроде.
Видно, что при высоких концентрациях оба ингибитора резко
Рис. 3.6. Влияние глицерофосфата ( •, к.) и фосфата (О, А) на
деаминирование. О, • АМР; V, Б- аденозин.
- Lg Сингибитор ( М )
42
Глава 3
подавляют деаминирование АМР, но очень слабо влияют на деаминирование
аденозина.
Как известно [47], активность АМР-деаминазы зависит от присутствия ионов
калия. Исследование влияния калия на деаминирование АМР в клетках
слизистой оболочки тонкого кишечника мыши, мешающее работе аденозинового
биосенсора, показало, что в данном случае такая зависимость отсутствует.
С другой стороны, щелочная фосфатаза тонкой кишки стереоспецифично
ингибируется L-фенилаланином [20, 21]. Ингибирующее влияние L-
фенилаланина на функцию электрода к АМР отчетливо проявляется при
концентрации L-фенилаланина 0,1 М. Фактически в этих условиях тканевый
электрод вообще не проявляет чувствительности к АМР.
Для рассматриваемых ферментов оптимальные значения pH составляют
приблизительно 6,5 (АМР-деаминаза) [14] и от 7,0 до 9,0 (щелочная
фосфатаза) [27]. Оптимальное значение pH для деаминирования АМР в клетках
слизистой оболочки тонкого кишечника мыши составляет 8,2, т. е. находится
в оптимальном диапазоне щелочной фосфатазы. Диапазон pH от 9,0 до 9,4
является оптимальным для ферментативного деаминирования аденозина.
Известно, что мышечные ткани отличаются высокой активностью АМР-деаминазы
[14], а для клеток слизистой оболочки тонкого кишечника млекопитающих
характерен высокий уровень активности щелочной фосфатазы [27].
Опубликованные ранее данные по соотношению активностей этих ферментов в
клетках разных типов и представленные выше данные, в том числе о
ингибирующем действии глицерофосфата, фосфата и L-фенилаланина,
отсутствии активации ионами калия и оптимальных pH для побочных
процессов, свидетельствуют о том, что в данном случае нежелательный
процесс обусловлен сопряжением щелочной фосфатазы и аденозиндеаминазы в
биокаталити-ческом слое, образуемом клетками слизистой оболочки.
Исходя из приведенных выше результатов, можно заключить, что при pH 9,0
буферная система, содержащая фосфат-ионы, должна эффективно подавлять
мешаю-
С субстрат ( М )
Рис. 3.7. Аналитический сигнал биосенсора на основе ткани слизистой
оболочки тонкого кишечника мыши. О-аденозин; П-АМР; ' ЛОР; 9 - АТР.
Биосенсоры на основе растительных и живых тканей
43
щие ферментативные процессы в тканевом аденозиновом электроде и в то же
время стимулировать желаемую биокаталитическую реакцию. Рис. 3.7
показывает, как изменяется избирательность электрода к аденозину в
буферном растворе, содержащем 0,1 М Трис НО, 0,2 М К2НР04 и 0,02% NaN3
(pH 9,0). В этих условиях электрод не обладает электродной функцией к
AMP, ADP и АТР. Проверяли и другие соединения, которые в принципе могли
бы оказывать мешающее влияние: З'-АМР, сАМР, аденин, гуанозин и гуанин.
Они также практически не влияют на сигнал тканевого электрода.
Таким образом, хотя селективность по отношению к аденозину не является
специфическим свойством тканевого аденозинового биосенсора, ее можно
существенно улучшить, выявив метаболические процессы, обуславливающие
