Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
прочно удерживается на месте. Собранный биосенсор оставляют вымачиваться
на ночь в указанном выше буферном растворе для удаления фонового аммиака
из биокаталитического слоя.
Характеристики биосенсора АМР на основе порошка из обработанной ацетоном
мышцы кролика также приведены в табл. 3.4. Видно, что по основным
характеристикам данная система весьма близка к тканевому биосенсору. Оба
биосенсора превосхо-
Биосенсоры ни основе растительных и живых тканей
45
Таблица 3.4. Сравнение характеристик биосенсоров АМР
Характеристика Фермент Кусочек ткани Высушенный ацетоном порошок
Наклон, мВ/рС 46 58 57
Диапазон линейности (п ¦ 10 4), М 0,8-150 1,4-100 3,3-130
Предел обнаружения (и-10-5), М 6,0 4,8 4,0
Время отклика, мин 2-6 2,5-8,5 2,5-8,0
Срок службы, дни 4 28 25
дят ферментный как по величине наклона градуировочной кривой, так и по
сроку службы. Поскольку тканевый порошок обычно доступнее и дешевле, по-
видимому, его и следует использовать в большинстве случаев как
биокатализатор для определения АМР.
3.4. Гуаниновый биосенсор
По мере появления новых типов биочувствительных датчиков становится все
более очевидной необходимость разработки эффективного подхода к
оптимизации тканевых биокатализаторов. Один из подходов был предложен в
работе [11]. В нем особое внимание уделяется происходящим в биосенсоре
биохимическим процессам и мембранным фазам. Иллюстрацией его
практического применения может служить оптимизация гуанинового
биосенсора, конструкция которого включает фрагмент ткани печени кролика и
газоаммиачный сенсор. Основной биокаталитический процесс описывается
уравнением
Гуанин + Н20 ксантин + NH3.
Гуаниновый биосенсор собирают следующим образом. Слой печени кролика
толщиной 0,5 мм помещают между двумя целлюлозными диализными мембранами.
Эту трехслойную систему помещают на газопроницаемую мембрану аммиачного
датчика и собирают сенсор, как обычно. Свежеприготовленные сенсоры
оставляют вымачиваться на ночь в 0,2 М боратном буферном растворе (pH
8,0), содержащем 0,02% азида натрия. В промежутках между измерениями
гуаниновые сенсоры хранят в этом же растворе при комнатной температуре.
Оптимизация характеристик тканевого биосенсора должна включать и
экспериментальное изучение различных параметров сенсора. Как правило,
необходимо детально рассмотреть методику иммобилизации тканевого слоя,
влияние pH, активаторов и ингибиторов, срок службы и общую
избирательность биосенсора. Существует несколько методов иммобилизации
тканевого слоя, основанных либо на физическом его удерживании подходящей
мембраной, либо на захвате химически сшитым белковым носителем. Многие
тканевые материалы достаточно прочны и могут быть относительно легко
иммобилизованы при помощи найлоновой сетки. В случае же гуанинового
биосенсора ткань печени кролика прижимают к поверхности электрода
мембраной из диацетилцеллюлозы, поскольку эта ткань не обладает
достаточной механической целостностью, позволяющей использовать
крупноячеистую найлоновую сетку.
Для нормального функционирования тканевых биосенсоров важно учитывать
влияние pH и концентрации как активаторов, так и ингибиторов. От pH
раствора зависит как биокаталитическая активность ферментов, так и
потенциал газочувствительного мембранного электрода. Для усиления
желательных и подавления мешающих ферментативных реакций в систему часто
вводят соответствующие активаторы и
46
Глава 3
ингибиторы. Обычный метод изучения их эффекта заключается в измерении
начальной скорости ферментативной реакции, когда скорость образования
продуктов непосредственно связана с эффективной биокаталитической
активностью фермента [24]. Несмотря на то что метод может дать только
относительную информацию, он быстр и удобен для сравнения различных
растворов. Следует только иметь в виду, особенно при изучении влияния pH,
что начальная скорость изменения сигнала биочувствителыгого датчика
определяется как каталитическим, так и чувствительным компонентом.
Поэтому такие измерения позволяют одновременно оптимизировать систему по
каждому из этих параметров. В случае гуанинового сенсора скорость
образования аммиака максимальна при pH 9,5. Однако если принять во
внимание стабильность биокатализатора и срок службы электрода, то
значение pH 8,0 оказывается более практичным, хотя при этом достигается
всего лишь 50% максимальной биокаталитической активности.
Срок службы биосенсоров часто ограничивается стабильностью
биокаталитическо-го компонента [2]. Для продления срока службы
биосенсоров приходится вводить стабилизирующие агенты и оптимизировать
условия хранения. Важность подбора соответствующих условий хранения
хорошо видна на примере гуанинового сенсора, в котором использована ткань
печени кролика. Оптимальные значения pH для активности и стабильности
биокатализатора в этом сенсоре не совпадают. На рис. 3.9 показано
изменение во времени активности гуаназы при pH 9,5, что соответствует
оптимуму для каталитической реакции. Быстрое падение активности фермента
