Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
превосходят полученные в системе с выделенным ферментом (табл. 3.2).
Селективность митохондриального глутаминового биосенсора оказалась очень
высокой [8].
Успех в создании митохондриального биосенсора показывает, что
субклеточные материалы могут служить эффективными биокатализаторами. Хотя
это и не относится к рассмотренному глутаминовому биосенсору,
субклеточные фракции можно использовать для улучшения чувствительности и
избирательности биосенсора в тех случаях, когда цельные фрагменты тканей
не обладают необходимыми свойствами.
3.14.1 Механизм отклика тканевого биосенсора
Механизм функционирования электродов на основе тканей растительного или
животного происхождения еще не установлен. До сих пор фактически не
проводилось фундаментальных исследований, касающихся механизмов переноса
молекул субстратов и продуктов в тканевом биокаталитическом слое.
Выяснение механизма транспорта важно для более широкого и эффективного
использования тканевых материалов в качестве аналитических реагентов.
Субстрат должен транспортироваться внутри биокаталитического слоя таким
образом, чтобы вступать в контакт с ферментом в клетках ткани. Понятно,
что прежде чем вступить в контакт с ферментом, субстрат должен проникнуть
внутрь иммобилизованной клетки. Кроме того, необходимо учитывать
транспорт из клеток вещества, непосредственно определяемого электродом.
Дело осложняется еще и тем, что основной фермент может локализоваться в
специфических внутриклеточных органеллах, а это предполагает наличие
дополнительных механизмов переноса субстрата в органел-лы и внутри них и
вывода продуктов. Экспериментальные [10] и теоретические [13]
54
Глава 3
I
II
III
IV
Мембрана клетки
Рис. 3.11. Схематические изображения моделей взаимодействия субстрат -
фермент в тканевых биосенсорах. О - субстрат; Е-активный фермент; tp -
транспортный белок.
исследования зависимости аналитических характеристик биосенсора от
процесса диффузии субстрата в биокаталитическом слое указывают на то, что
выяснение механизмов транспорта имеет важное прикладное значение,
поскольку от них зависят аналитические свойства тканевых биосенсоров.
Для описания взаимодействия между субстратом и ферментом в тканевом
биокаталитическом слое предложено несколько моделей, схематически
представленных на рис. 3.11.
Модель I описывает случай, когда наружные клетки тканевого слоя полностью
разрушаются, выделяя основной фермент на поверхность сенсора. По мере
старения электрода остатки мертвых клеток удаляются с его поверхности, а
экспонируемый при этом свежий слой клеток генерирует новую порцию
фермента. В этой модели исключаются осложнения, связанные с входом
субстрата в клетки. Необходимо, чтобы скорость высвобождения фермента
была постоянной (это согласуется с наблюдаемой высокой воспроизводимостью
результатов) и низкой (чтобы обеспечить достаточное количество фермента в
течение длительного периода, например 30 дней).
В работе [3] в предварительных исследованиях оценивали структурную
целостность клеток ткани почки свиньи. С этой целью кусочек ткани
суспендировали в небольшом количестве 0,1 М фосфатного буферного раствора
(pH 7,8), содержащего 0,02% азида натрия. Суспензию оставляли на ночь при
комнатной температуре, затем центрифугировали и отделяли клетки. В
растворе под осадком определяли фермент глутами-назу, активность которой
используется в глутаминовом биосенсоре, и обнаружили лишь небольшое ее
количество. Полученный при центрифугировании осадок почечных клеток вновь
суспендировали в свежем буферном растворе. Эту смесь опять выдерживали в
течение ночи при комнатной температуре и центрифугировали. Во второй раз
в растворе под осадком не обнаружили глутаминазной активности, хотя в
самих почечных клетках содержание фермента было довольно велико.
Приведенные выше результаты показывают, что целостность клеток
сохраняется, по крайней мере в начале использования почечных клеток в
качестве биокатализатора. Небольшое количество глутаминазы в первом
растворе, вероятно, выделяется из фрагментов клеток, образующихся при
вырезании кусочка ткани из целого органа.
Модель II описывает возможный случай, когда иммобилизованные клетки
повреждены в достаточной степени, чтобы обеспечить свободную диффузию
молекул субстрата и продукта внутрь клеток и наружу, но не настолько,
чтобы основной фермент диффундировал с поверхности электрода. Проведенное
недавно исследование проницаемости клеток показало, что такие каналы
могут образовываться во внешних мембранах как прокариотических, так и
эукариотических клеток, например при
Биоеенеоры на основе растительных и живых тканей
55
осмотическом шоке и циклах замораживания-размораживания [18]. Подобные
каналы, возможно, образуются в иммобилизованных кусочках тканей в
процессе сборки электрода либо при промывании тканевого слоя водой, либо
при оттаивании предварительно замороженного тканевого материала.
Модели III и IV соответствуют случаям, когда на поверхности электрода
