Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
сохраняют природное сродство к кислороду. Степень мешающего влияния
кислорода в основном определяется относительными концентрациями кислорода
и ферроцений-ионов вблизи участка фермента, ответственного за перенос
электрона, так как скорости реакций обоих реагентов близки [17]. В
результате если анализируемый раствор насыщен кислородом, то
амперометрический сигнал типичных оксидазных электродов снижается почти
на 30% [11, 20]. В ферроцен-модифицированных электродах, содержащих NAD
(Р) + -независимые дегидрогеназы, эта проблема устраняется полностью. Они
не обнаруживают заметного уменьшения тока даже в насыщенных кислородом
растворах [5, 19, 52]. Хотя желательно избегать введения таких
неустойчивых, дорогих и хорошо растворимых компонентов, как NAD(P + ), в
ферроцен-модифицированных электродах все же можно использовать
дегидрогеназы, зависимые от этого кофактора, добавляя в систему второй
фермент. С помощью ферроцен-модифицированного электрода можно
каталитически сопрягать как липоамиддегидрогеназу (диафоразу), так и
глутатионредуктазу. При этом реализуется следующая схема:
Субстрат ^ NAD(P)* > 2 Fе(ср)г ^
Дегидрогеназа Диафораза
I \ )\ глутатионредуктаза
У ^ А УУ
Продукт NAD(P)H 2 Fe(cp)\ 2е
Представляет интерес применение электрода на основе глюкозооксидазы и
ферроцена для определения других веществ с помощью ферментов, которые
конкурируют с глюкозооксидазой. Например, в присутствии АТР и гексокиназы
глюкоза превра-
216
Глава 15
ОН
Рис. 15.2. Типы полимеров на основе п- и о-хинонов, используемых для
модификации угольного и платинового электродов.
щается в глюкозо-6-фосфат. Следовательно, глюкозный электрод можно
использовать для определения АТР [8]:
Возможность определения АТР, NAD4 и NADP+ значительно расширяет диапазон
доступных для анализа веществ, в том числе клинически важных ферментов.
Так, добавление креатинфосфата в описанную выше систему для определения
АТР позволяет определять креатинкиназу, что является важным признаком при
диагностике инфаркта миокарда.
До сих пор мы рассматривали примеры различных вариантов глюкозного
сенсора на основе ферроцена. Для разработки новых ферментных электродов
[45] и иммуносенсоров (гл. 4) можно, однако, использовать и другие
ферментные системы.
Для регенерации окисленных ферментов используют также модифицированные
электроды с адсорбированными редокс-полимерами, содержащими п- и о-
хинонные группы (рис. 15.2) [12-14]. Такие электроды эффективно окисляют
восстановленные глюкозооксидазу, L-лактатоксидазу и ксантиноксидазу в
диапазоне потенциалов от 0,05 до 0,5 В (относительно Ag/AgCl) при pH 7.
Установлено [12-14], что эти ферменты окисляются при потенциале окисления
полимерного модификатора, и, таким образом, последний действует как
медиатор. Основной недостаток этих редокс-полимерных электродов
заключается в том, что они довольно быстро (обычно за 5 дней) теряют
каталитическую активность [12, 14]. Позже был описан [3]
амперометрический глюкозный сенсор на основе глюкозооксидазы,
иммобилизованной на графите, который предварительно обработали N-
метилфеназинием (NMP). Авторы нашли, что функция электрода к глюкозе
строго линейна в диапазоне 0,5-150 мкМ, но использовать его можно вплоть
до концентрации 2 мМ. Иммобилизованная глюкозооксидаза стабильна в
течение нескольких месяцев, однако медиатор следует обновлять ежедневно.
15.3. Ферментные электроды, основанные на регенерации кофактора
АТР
Глюкоза
ADP
Глюкоза- Гпюконат -6- сроссрат
Еще одна группа ферментов, которые можно использовать в биосенсорных
устройствах,-это никотинамидадениндинуклеотид-зависимые дегидрогеназы. От
рас-
Перелое электрона от биологических молекул на электроды
217
смотренных выше оксидаз эти ферменты отличаются тем, что они не содержат
активного редокс-центра per se, а выполняют свою каталитическую функцию с
помощью кофактора никотинамиддинуклеотида (рис. 15.3).
С никотинамиддинуклеотидными кофакторами обычно связывают реакции с
переносом атома водорода типа
В этой реакции один атом водорода субстрата непосредственно переносится к
NAD+, а другой переходит в раствор в виде протона. Оба протона, теряемые
субстратом, переносятся на никотинамидное кольцо. В амперометрическом
ферментном электроде на основе рассматриваемых дегидрогеназ
ферментативную активность измеряют рециклированием восстановленного
NAD(P)+ на соответствующем электроде:
При создании биосенсора этого типа существенным элементом является подбор
подходящей электрокаталитической поверхности для эффективного реокисления
ко-фермента в биологически активную форму, т.е. в форму, узнаваемую
ферментом. В идеальных условиях (0,1 М NADH, pH 7) NAD+ можно
регенерировать из NADH на "голом" электроде. Этот подход, однако, имеет
свои недостатки. Для регенерации NAD+ на платине требуется большое
перенапряжение (1,1 В относительно н. к.э.),
н
NAD* + R - С - R' = NADH + R - С - R' + Н*
ОН
О
Сюда при восстиновлени. и входит гидрид-ио>
