Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
использовать в качестве индикаторных электродов. Во-вторых, зависимость
концентрации анализируемого вещества С от потенциала электрода Е является
экспоненциальной:
lnC = const + nEF/RT, где п - заряд иона; F-число Фарадея; R-газовая
постоянная и Т-абсолютная гемпера-
* Ферментативная реакция может приводить к образованию электроакгивного
продукта, который можно определять амперометрически, либо к изменению
концентрации каких-либо ионов, например Н + : в этом случае возможно
потенциометрическое определение-Прим. авт.
14*
212
Глава 15
тура. Поэтому небольшая ошибка при измерении Е может привести к довольно
значительной погрешности определения С. Например, при п = 1 погрешность
измерения Е в 10 мВ приводит к 19%-ной погрешности для величины С [2].
Из-за этих недостатков биосенсоры на основе амперометрических
индикаторных электродов считаются более практичными, хотя в большинстве
случаев необходимо строго контролировать гидродинамические условия вблизи
поверхности электрода.
Ферменты, принимающие участие в окислении или восстановлении
биологических молекул (оксидоредуктазы), либо содержат в активном центре
группу, которая может окисляться/восстанавливаться, например железо,
медь, флавин или хинон, либо выполняют свою биологическую роль совместно
с каким-либо редокс-кофактором, например NAD(P) + . Из-за трудности
осуществления прямой электрохимической реакции между редокс-центром и
"голым" электродом и отсутствия эффективных электро-каталитических
поверхностей для рециклирования восстанавливаемого кофактора в первых
ферментных электродах электрохимические процессы лишь косвенно влияли на
активность фермента. Классическим примером является сенсор глюкозы на
основе фермента глюкозооксидазы и полярографического кислородного
электрода, предложенный Кларком и Лайонсом [15] в 1962 г. и
усовершенствованный Апдайком и Хикссом [54] в 1967 г. (гл. 1).
Глюкозооксидаза представляет собой FAD-coдержащий фермент (рис. 15.1),
катализирующий окисление глюкозы в глюконовую кислоту:
Глюкоза + 02 + Н20 = глюконовая кислота + Н202.
В каталитическом цикле флавиновая простетическая группа сначала
восстанавливается глюкозой и затем реокисляется молекулярным кислородом.
Количество присутствующей в растворе глюкозы определяют, следя либо за
скоростью расхода кислорода, либо за скоростью образования пероксида
водорода. Такая система хотя и функционирует, но все же имеет ряд
недостатков. Во-первых, измеряемый ток зависит не только от концентрации
глюкозы, но и от парциального давления кислорода (р02) в растворе. Во-
вторых, при потенциалах восстановления кислорода или окисления пероксида
водорода в системе могут протекать различные побочные реакции. Наконец,
Рибофлавин- 5'- сросфат АМР
/-------------------------------------------- ч Г
Рис. 15.1. Механизм действия флавинового кофермента. Пунктирной линией
выделена область, которая изменяется при протекании реакции.
Перенос электрона от биологических молекул на электроды
Г
213
окисление пероксида водорода до кислорода зависит от концентрации
протонов:
Н202 = 2Н+ + 02 + 2е.
Таким образом, ток может весьма заметно варьировать в зависимости от pH
раствора. Ясно, что надежное применение этого датчика возможно лишь при
условии, что pH и рОг раствора тщательно контролируются, что даже в
лабораторных условиях встречается редко. Решение этих проблем позволило
бы приступить к разработке ферментных электродов более широкого
назначения. О разработке таких электродов и будет идти речь в этой главе.
15.2. Медиаторы и химически модифицированные электроды
Хотя для оксидаз, например глюкозооксидазы, молекулярный кислород
является физиологическим акцептором электронов, в большинстве случаев его
можно заменить переносящим электрон медиатором. В данном контексте под
медиатором понимается низкомолекулярная редокс-пара, которая переносит
электроны от редокс-центра фермента к поверхности индикаторного
электрода. В каталитическом цикле медиатор сначала реагирует с
восстановленным ферментом и затем диффундирует к поверхности электрода,
где подвергается быстрой электрохимической реакции с переносом заряда.
Это можно проиллюстрировать на примере системы с глюкозооксидазой, где
протекают следующие процессы:
в растворе:
глюкоза + FAD + Н20 = глюконовая кислота + FADH2 FADH2 + Мох = FAD + Mred
+ 2Н +
на электроде:
Mred = Мох.
Скорость образования в растворе восстановленного медиатора Mred измеряют
амперометрически, окисляя его на электроде.
Использование медиатора дает ряд явных преимуществ. При условии, что
медиатор в восстановленной форме не реагирует с кислородом, результаты
измерений становятся фактически независимыми от р02. Во-вторых, рабочий
потенциал ферментного электрода теперь определяется формальным
окислительно-восстановительным потенциалом (?°) медиаторной пары, что
особенно удобно, если значение ?° мало, поскольку при этом меньше
вероятность протекания побочных реакций. Наконец, если в процессе
