Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
окисления восстановленного медиатора не участвуют протоны, то ферментный
электрод может быть относительно нечувствителен к изменениям pH
(очевидно, что прибор нельзя эксплуатировать при очень низких или высоких
pH, где имеет место денатурация фермента).
Использование медиаторов в сочетании с оксидоредуктазами никоим образом
не является нововведением. В качестве медиаторов более или менее успешно
служат молекулы (например хиноны), органические и неорганические
(например феррицианид) ионы, редокс-красители [7]. Для использования на
практике медиатор должен удовлетворять следующим критериям:
1) он должен быстро реагировать с восстановленным ферментом;
2) гетерогенные реакции с его участием должны быть обратимыми;
3) перенапряжение процесса регенерации окисленного медиатора должно быть
низким и не зависеть от pH;
214
Глава 15
4) медиатор должен быть устойчив как в окисленной, так и в
восстановленной форме;
5) восстановленный медиатор не должен реагировать с 02;
6) для многих приложений требуется, чтобы медиатор был нетоксичным.
Хотя использование медиаторов действительно дает явные преимущества, при
введении его в раствор образца приходится сталкиваться с некоторыми
сложностями. Практичнее было бы прочно поставить медиатор "на якорь" на
поверхности электрода так, чтобы он оставался электрохимически активным и
мог реагировать с восстановленным ферментом. На сегодняшний день одним из
лучших классов медиаторных соединений являются ферроцен (п5-
бис(циклопентадиенил)железо) и его производные:
Ферроцен представляет собой я-ареновый комплекс переходного металла,
который состоит из атома железа, зажатого двумя циклопентадиениловыми
кольцами. С электрохимической точки зрения это классическая редокс-пара
(?° = 165 мВ относительно н.к. э.), на физические и химические свойства
которой можно влиять, вводя заместитель в любое из двух колец
молекулярной системы [43]. Первый успешно работающий ферментный электрод
на основе ферроцена содержал нерастворимое производное ферроцена и
глюкозооксидазу [11]. Проще говоря, 1,1'-диметилферроцен внедрили в
графитовый электрод, на котором химически иммобилизовали глюкозооксидазу
(гл. 16). В этой конфигурации электрохимически генерированный ферроцений-
ион действует как окислитель восстановленной глюкозооксидазы.
Образовавшаяся при этом восстановленная форма ферроцена реокисляется на
поверхности электрода в результате поляризации электрода при пропускании
тока. Последовательность реакций, протекающих на электроде, можно
представить в виде
Такой сенсор имеет следующие преимущества:
1) Ферроцений-ионы генерируются при довольно низком потенциале (220 мВ
относительно Ag/AgCl), что позволяет свести к минимуму побочные реакции.
2) Восстановленный ферроцен не реагирует с кислородом и поэтому сенсор не
чувствителен к последнему.
3) Реакция с переносом электрона между ферроцений-ионом и восстановленным
ферментом протекает быстро, соответственно время отклика электрода
невелико.
4) Вследствие низкой растворимости медиатор фактически закреплен на
поверхности электрода, что позволяет не вводить его предварительно в
анализируемый раствор.
5) Поскольку и сам фермент иммобилизован на поверхности преобразователя,
сенсор можно использовать многократно.
Глюкозный электрод, разработанный Кассом и др. [11], проявляет строго
линейную функцию к глюкозе за пределами физиологического диапазона
концентраций (вплоть до 30 мМ), сохраняя в то же время малые времена
отклика (время нарастания
Fe
Перепое электрона от биологических молекул на электроды
215
тока до 95% от стационарного уровня составляет 60-90 с). Такие
характеристики были достигнуты путем использования покрытого губчатым
углем электрода из фольги, что обеспечивает достаточное гидродинамическое
ограничение диффузии субстрата без каких-либо дополнительных мембран. При
проведении анализа в аэробных и анаэробных условиях сигналы электродов
практически одинаковы, а если электрод покрыть мембраной, не пропускающей
анионы, то удается в значительной степени устранить помехи, обусловленные
обычно присутствующими в плазме крови метаболитами, такими, как аскорбат.
После первой публикации по этой теме в сочетании с ферроцен-
модифицированным электродом использовали множество оксидоредуктаз (табл.
15.1). Этот способ кон-
Таблица 15.1. Ферменты, связываемые с ферроцен-модифицированным углем в
ферментных электродах
С'> бстрат Фермент
L-Аминокислоты L-Аминокислотная оксидаза
Оксид углерода СО-Оксидорсдуктаза
Глюкоза Глюкозооксидаза, или PQQGDH
Гликолевая кислота Гликолятоксидаза
Лактат Лактатоксидаза или LDH
NADH Глутатионредуктаза или диафораза
Пируват Пируватоксидаза
струирования электродов, видимо, имеет самое общее применение [49]. В
таких электродах особенно удачно сочетание с NAD (Р) + -независимыми
дегидрогеназами, например хинопротеинами [50]. Хотя ферроцений-ионы
действуют как высокоэффективные переносчики электрона между
восстановленными оксидазами и электродами в анаэробных условиях, оксидазы
