Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
О
i-NH8
Витамин
никотинамид
\
О -СН3 /О
Восстановленное
никотинамидное
кольцо
\
он он
D-рибози,
Рис. 15.3. Переносчик водорода кофермент NAD.
218
Глава 15
и длительное использование электрода приводит к загрязнению его
поверхности накапливающимися высокомолекулярными продуктами окисления.
Необходимость преодоления этих трудностей привела к разработке
модифицированных поверхностей на основе таких веществ, как катехолы [32].
гидрохиноны [47] и редокс-красители [24, 29]. При изготовлении химически
модифицированных электродов для окисления NADH руководствуются той
логикой, что если редокс-пара окисляет NADH в растворе и каким-то образом
удерживается на поверхности электрода, то и получающийся при этом
модифицированный электрод должен обладать способностью к электрокаталити-
ческой регенерации NAD + . Для модификации можно использовать просто
пассивную адсорбцию редокс-пары на поверхности электрода либо
синтетический путь, включающий ковалентное связывание редокс-пары с
электродом посредством бифункциональных реагентов, таких как замещенный
силан или цианурхлорид. Имеется превосходный обзор Мэррея [42],
посвященный химически модифицированным электродам, а кинетические
характеристики таких электродов подробно обсуждаются в настоящей книге
(гл. 13).
На модифицированном электроде окисление NADH протекает с участием
медиатора и катализируется иммобилизованной редокс-парой O/R:
Здесь О и R- окисленная и восстановленная формы поверхностного медиатора.
Если скорость медиаторной реакции велика, а скорость восстановления или
окисления иммобилизованной пары еще выше, то субстрат (NADH) начинает
окисляться при потенциале, близком к стандартному потенциалу Е° для
данной пары O/R. Это значительно уменьшает перенапряжение
электрохимической реакции и, таким образом, подавляет посторонние
процессы. Кроме того, окисление NADH протекает с высокой эффективностью
(относительно рециклирования биологически важного NAD+) и не загрязняет
электрод.
Наряду с отмечаемыми выше достоинствами модифицированные электроды имеют
и недостаток - они не могут стабильно работать в течение долгого времени.
Обычно нестабильность проявляется десорбцией медиатора с поверхности
электрода, что приводит к уменьшению электрокаталитической активности.
Особенно это относится к случаям, когда медиатор адсорбирован на
поверхности электрода. Хотя медиаторы, ковалентно присоединенные к
электродным поверхностям, действительно обеспечивают большую
стабильность, это достигается за счет более сложной и часто более
длительной химической обработки.
Разработанный недавно новый электрод на основе высокопроводящих
органических полимеров оказался наиболее подходящей системой для
регенерации NAD+ из NADH ([1, 34]; гл. 12). В этом электроде использованы
устойчивые комплексы с переносом заряда, образующиеся путем частичного
переноса электрона от донора, например 7,7,8,8-тетрациано-и-хинодиметана
(TCNQ), к акцептору, например тетратиафульва-лену (TTF) или N'-
метилфеназинию (NMP).
TCNQ
NMP +
TTF
Перепое электрона от биологических молекул на электроды
219
При комнатной температуре эти донорно-акцепт орные комплексы являются
органическими металлами с проводимостью 500 Ом см-1 для TTF+TCNQ и 200
Ом-1 -см-1 для NMP+TCNQ~ [8]. Химические и физические свойства
органических металлов подробно описаны [23], равно как и их электрические
характеристики [31]. Окисление NADH на электродах из N М Р 4 ТС N Q
происходит при -0,2 В (относительно Ag/AgCl) [34]. Если использовать
такие электроды в сочетании с алкогольдегидро-геназой, ток заметно
увеличивается в присутствии этанола [36], при этом были получены
следующие экспериментальные параметры: кажущаяся км = 15,4 мМ, *мах = 1.3
мкА-см"2. Тот же электрод можно использовать для детектирования
ацетальдегида в присутствии NADH с кажущейся константой скорости км = 54
мкМ. Предполагается [34], что окисление NADH на N М Р4 Т С N Q " -
электроде протекает по медиаторному механизму и что в ней участвуют
генерируемые электрохимически ионы NMP + , поскольку комплекс NMP ' TCNQ
не проявляет способности к электро-каталитическому окислению NADH. Прежде
чем внедрить дегидрогеназу в реально действующее устройство, необходимо
решить проблему введения экзогенного кофактора в раствор. Это требование,
очевидно, ограничивает использование таких сенсоров для непосредственных
измерений и в режиме "на линии". Одним из путей решения данной проблемы
может быть применение избирательно проницаемых мембран для локализации
NAD(P)+ у поверхности электрода. Удержать кофактор у поверхности можно
также с помощью химической иммобилизации или за счет увеличения его
эффективного молекулярного веса путем ковалентного присоединения к
высокомолекулярному веществу, например декстрану ([16], гл. 6).
15.4. Амперометрические сенсоры на основе редокс-белков
Сопряженный амперометрический ферментный электрод этого типа по существу
представляет собой устройство, в котором восстановленная оксидоредуктаза
