Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
скоростях развертки, при фиксированной концентрации фермента можно
получить ряд значений к(/а. Далее, построив график зависимости kf/a от
1/v, можно исключить влияние скорости развертки. Для реакции
псевдопервого порядка наклон начального участка этой зависимости равен
krRTjnF, откуда можно рассчитать константу скорости реакции псевдопервого
порядка, не зависящую от скорости развертки. Для оценки константы
скорости реакции второго порядка ks = fcf/[Z] для гомогенной реакции
между окисленным медиатором и восстановленным кофактор-ферментным
комплексом (уравнение (14.6)) проводят опыты при различных концентрациях
фермента.
Важно отметить, что до сих пор мы предполагали равенство коэффициентов
Рис. 14.2. Изменение функции пикового тока г'р/у1'2 в зависимости от
скорости развертки потенциала для диффузионно контролируемой
электрохимической реакции (1) и для каталитической сопряженной реакции
типа (14.6) (2).
Ферментативные реакции в медиаторных биосенсорах
207
Рис. 14.3. Теоретическая зависимость отношения токов пика для случаев
кинетического и диффузионного контроля, ik/id, от кинетического параметра
(kf /а)1,2.
диффузии компонентов О и Z. Это, очевидно, неверно для реакций белков с
медиаторами, молекулы которых малы. Райэн и Уилсон [25] показали, что
если реакция является очень быстрой (т.е. ее константа скорости больше
106 л-моль-1-с-1), то значение константы скорости может быть завышено.
Тем не менее данный метод остается полезной альтернативой методу
остановленного потока, используемому для исследования кинетики подобных
реакций [21, 28].
С помощью циклической вольтамперометрии изучено множество оксидоредуктаз
(табл. 14.1). В качестве медиатора использовали ион ферроцения,
образующийся
Таблица 14.1. Определенные электрохимически константы скорости реакций
восстановленных форм различных ферментов с ферроцений-ионом
ферроценмонокарбоновой кислоты при pH 7,0 и 298 К
Фермент Субстрат 10 5, л моль ] -с 1
Глюкозодегидрогеназа Глюкоза 93,0
Флавоцитохром Ь2 Лактат 67,0
Г алактозооксидаза Г алактоза 8,5а
Ксантиноксидаза Ксантин 4,0
СО-оксидоредуктаза Оксид углерода 4,0
Глутатионредуктаза NADPH 2,0
Глюкозооксидаза Глюкоза 2,0
Гликолятоксидаза Гликолят 1,26
Алкогольдегидрогеназа Метанол 0,6 я
L-Аминокислотная оксидаза Лейцин 0,4г
Пируватоксидаза Пируват 0,2
Липоамиддегидрогеназа NADH 0,2
Саркозиноксидаза Саркозин 0,1
Холестериноксидаза Холестерин -
Оксалатоксидаза Оксалат Д
Холиноксидаза Холин
" pH 9,0; 6 pH 8,3; " pH 10,5; ' pH 7,8, 310 К; д pH 3,0
208
Глава 14
в растворе ферроценкарбоновой кислоты. В случае кислород-специфичных
ферментов холестериноксидазы, оксалатоксидазы и холиноксидазы не
наблюдалось каталитической реакции. Для остальных ферментов, приведенных
в табл. 14.1, оценены соответствующие константы скорости [2, 7-9, 12,
14].
Значения констант скорости реакции с ферроценом для кислород-
неспецифичных флавоферментов лежат в диапазоне 104 - 106 л-моль-1 - с-1,
т. е. в том же диапазоне, что и для реакции с кислородом [5, 16]. Отсюда
авторы работы [5] сделали вывод, что каталитическая активность этих
ферментов связана с окислением субстрата, а не последующим реокислением
флавиновой группировки. Из сравнения этих данных следует, что
использование нефизиологического акцептора с кислород-неспецифичны-ми
флавопротеинами не приводит непременно к каким-либо осложнениям. Однако
на практике в биосенсорах, основанных на реакции этого типа, важно свести
к минимуму побочную реакционную способность фермента по отношению к
кислороду.
На сегодняшний день лучше других изучен фермент глюкозооксидаза, для
которой определены температурные и pH-зависимости констант скоростей
реакции с различными производными ферроцена (табл. 14.2). Интересно, что,
хотя во всех случаях эта
Таблица 14.2. Определенные электрохимически константы скорости реакции
восстановленной глюкозооксидазы с ферроцений-ионом для ряда производных
ферроцена при pH 7,0 и 298 К
Производное ферроцена Е112, мВ (отн. н. к.э.) ks -10 5, л-моль 1 с 1
.
1,1 '-Диметил ферроцен 100 0,8
Ферроцен 165 0,3
Винилферроцен 250 0,3
Ферроценмонокарбоновая кислота 275 2,0
1,1 '-Ферроцендикарбоновая кислота 285 0,3
М етилтриметиламиноферроцен 400 5,3
Поливинилферроцен 450 -
каталитическая реакция термодинамически выгодна, на электроде, покрытом
поливи-нилферроценом по методике [20], ее не удалось обнаружить. Это
может быть обусловлено неспособностью связанного с полимером ферроцена
проникать подобно мономеру в активный центр фермента и тем самым
обеспечивать быстрый перенос электрона.
Помимо изучения реакций между оксидоредуктазами и нефизиологическими
редокс-частицами циклическую вольтамперометрию используют для
исследования in vitro окислительно-восстановительных реакций между
белками. На золотом электроде, модифицированном дипиридилом,
электрохимическая реакция цитохрома с из сердца лошади обратима [15]. На
основании этого Хилл и Уолтон [18] показали, что цитохромоксидаза
