Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
существенно повысить процентное содержание (С) сшивающего агента
("сшивки") при неизменном общем содержании мономеров (% 7 - акрила-
мид+"сшивка") (Fawcett, Morris, 1966). Клейкие и непрочные "разбавленные"
полиакриламидные гели очень неудобны в обращении. Кроме того, размер пор
в них не превышает 80 нм (Righetti et al., 1981b). Более благоприятная
ситуация реализуется при использовании крупнопористых гелей с высоким
содержанием. "сшивки". По сути дела, этот подход был впервые использован
в работе Davis, 1964, где крупнопористый (концентрирующий) гель при диск-
электрофорезе имел состав 3% 7, 20% Свис. Гели с 50% С практически не
обнаруживают молекулярно-ситовых явлений по отношению к макромолекулам с
мол. массой до нескольких миллионов (Rodbard, 1972).
Характер изменений в пространственной структуре высоко-сшитых гелей был
эффектно продемонстрирован с помощью электронной микроскопии (Rfichel,
Brager, 1975; Riichel et al., 1978). Крестообразная диаграмма на рис. 3.6
наглядно показывает, каким образом изменяется структура матрицы в
зависимости от величины отношения Т/С. По горизонтали креста видны
структурные изменения, которые происходят при повышении Т при
фиксированном относительном содержании "сшивки" (С=5%). Начиная с
крупнопористых "разбавленных" гелей (7=2,5%) размер пор непрерывно и
монотонно уменьшается вплоть до образования очень плотной сетки матрицы с
высоким значением 7 (до 40%). Если же проследить за процессами,
происходящими с матрицей в результате изменения содержания сшивки при
фиксированном 7 (10%), то можно увидеть качественно иную картину. Как
показано на рис. 3.6, на обоих концах вертикали креста как при очень
низких (0,2%), так и при очень высоких (20% и выше) значениях С
образуются крупнопористые гели. Изменение пористости в зависимости от С
фактически описывается параболой с минимумом вблизи точки С = = 5%. Это
объясняет полученные ранее экспериментальные данные о том, что
максимальное замедление миграции макроионов происходит в гелях с С = 5-7%
(Fawcett, Morris, 1966; Hjer-ten et al., 1969; Margolis, Wrigley, 1975).
Трактовка явления крупнопористости гелей с высоким значением С была
предложена в работах Gelfi, Righetti, 1981 a,b, и Righetti, 1981. В самом
деле, при низких значениях С (2-4%)
Рис. 3.6. Электронно-микроскопические фотографии полиакриламидных гелей,,
различающихся по суммарному содержанию мономерных компонентов (% Т) и по
относительному содержанию "сшивки" - Ы^'-метиленбисакриламида (% С).
Приведенные дроби представляют отношение параметров Т/С для данных типов
ПААГ. В горизонтальном ряду снимков С остается постоянным, а Т
увеличивается слева направо. В этой серии с ростом Т происходит
уплотнение геля и уменьшение размера пор, что согласуется с известным
характером изменения молекулярно-ситовых свойств гелей. В вертикальном
ряду Т постоянно, а С возрастает снизу вверх. В этой серии наблюдается
почти параболическая зависимость между содержанием "сшивки" и ситовым
эффектом в ПААГ. (Ruchel et al., 1978.)
Аналитическое ИЭФ
175
полиакриламидный гель представляет собой гомогенную систему в том смысле,
что средняя плотность матрицы примерно постоянна по всему объему и
топологические элементы в подавляющем большинстве синглетны (т. е. на две
разные акрила-мидные цепи приходится одна сшивка). Топологические
искажения (нарушения регулярности структуры), в частности петли,
образующиеся в том случае, когда на две цепи приходится две сшивки, при
этом крайне редки. Однако при повышении С равновесие гелеобразования
постепенно смещается в сторону топологических искажений (петли и
дублеты), что сопровождается двумя взаимосвязанными процессами, а именно:
линейные полиакриламидные цепи становятся короче и толще, в то время как
узлы (места сшивки) увеличиваются в размерах. По мере дальнейшего роста С
линейные цепи постепенно исчезают, и новый набор топологических элементов
теперь состоит главным образом из сгустков пространственно переплетенных
петель, которые растут, формируя своего рода сферические образования или
гранулы. В действительности такие "кластеры", или "агрегаты", достигают
размеров, сопоставимых с длиной волны видимого света (300-700 нм), и гели
этого типа становятся практически непрозрачными (мутными). Мутные гели (с
высоким С) обладают следующими важнейшими свойствами: (а) нерегулярным
строением, т. е. неравномерным распределением цепей по объему матрицы,
которое порождает существование участков как с высокой, так и с низкой
плотностью; (б) высокой пористостью;
(в) меньшей эластичностью, чем в случае обычных прозрачных гелей; (г)
меньшей склонностью к набуханию в растворителе. Для иллюстрации
необычайно высокой эффективной пористости гелей с высоким значением С
можно провести следующую аналогию. В обычных умеренно сшитых гелях
макромолекулы мигрируют сквозь пространственную сетку геля через поры,
образующиеся между цепями матрицы. В высокосшитых гелях (или в гелях,
