Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
3.2.5. ИЭФ на ацетилцеллюлозных пленках
Использовать ацетилцеллюлозу в качестве матрицы для зонального
электрофореза впервые предложил Кон (Kohn, 1957). Этот метод, одно время
называвшийся просто электрофорезом по Кону, стал весьма популярен. Для
ацетилцеллюлозы совершенно несвойственны молекулярно-ситовые эффекты,
поэтому она могла бы служить идеальной матрицей и для ИЭФ. Тем не менее
содержание карбоксильных групп у поступавших в продажу пленок было
настолько велико, что ни о каком ИЭФ не могло быть и речи. Из-за крайне
низкой ионной силы в растворе сфокусированных амфолитов и без того
значительный электро-эндосмотический поток жидкости в пленке становился
еще сильнее. Применение для ИЭФ ацетилцеллюлозных мембран, обработанных
поверхностно-активным агентом Separax-EF (поставляется компанией Fuji
Photo, Tokyo, Japan), было впервые описано в работах Harada, 1975, и
Harada et al., 1980. Этот способ не получил широкого признания, возможно,
из-за все же значительного остаточного электроэндосмоса.
Позднее была описана методика исчерпывающего метилирования
ацетилцеллюлозных пленок, позволяющая получать матрицу, пригодную для ИЭФ
(Ambler, 1978а,b). И в этом случае ввиду неполного устранения эндосмоса
приходится проводить ИЭФ при концентрации амфолинов 8% (вместо обычных 2%
при работе с полиакриламидными гелями) и в присутствии 10%-ного
глицерина. При фокусировании в узком диапазоне pH в качестве католита и
анолита следует использовать слабые основания и кислоты, например 0,2 М
лизин и 0,2 М уксусную кислоту. Данную методику метилирования (с помощью
BF3 в метаноле) можно использовать только для обработки гелеобразных
ацетилцеллюлозных мембран (типа Cellogel). Она не
Аналитическое ИЭФ
183
подходит для метилирования "сухих" мембран, таких, как Sepra-phore III
(производства фирмы Gelman, Ann Arbor, MI, USA).. Впоследствии была
описана методика, пригодная и для обработки мембран последнего типа,
основанная на применении серии водных растворов с постепенно возрастающим
содержанием метанола (Ambler, Walker, 1979). И все же (по моему опыту
работы с ацетилцеллюлозными пленками) процесс ИЭФ в них нестабилен и с
трудом поддается контролю. Предстоит еще немало работы по улучшению
свойств самой матрицы и по стандартизации условий ИЭФ в ней. Для развития
этого метода было бы крайне целесообразно, чтобы фирмы наладили
производство и продажу тщательно обработанных стандартных ацетилцеллю-
лозных пленок для ИЭФ. На сегодняшний день в литературе описано ИЭФ на
мембранах типа Iso Sepraphore фирмы Gelman (Janik, Dane, 1981). Среди
ограниченного числа публикаций по применению этих мембран можно отметить
работу Boussios, Bertles, 1978, по изоэлектрическому фракционированию
цепей глобулина человека на мембранах, импрегнированных 5 М мочевиной и
5%-ным p-меркаптоэтанолом. Полученные авторами хорошие результаты,
вероятно, связаны с применением мочевины, которая, как отмечалось
(Gianazza et al., 1979), стабилизирует градиент pH за счет эффективного
подавления катодного дрейфа.
3.2.6. ИЭФ в тонком слое гранулированного геля
В этом разделе речь пойдет об аналитическом варианте метода Радолы,
который уже обсуждался в разд. 2.2.3. Гранулированные гели обладают
некоторыми преимуществами по сравнению с обычным полиакриламидным гелем.
При работе с гранулированным гелем можно не опасаться возникновения
артефактов, которые, как известно, иногда проявляются в обычных
полимерных гелях из-за присутствия в них катализаторов полимеризации
(разд. 3.2.9). В гранулированном геле пористость не является лимитирующим
фактором, т. е. стерические затруднения не возникают даже при
фокусировании очень крупных молекул.
По методологии аналитическое ИЭФ в слое гранулированного геля мало чем
отличается от препаративного варианта (см. разд. 2.2.3). В опыте
используют стеклянные подложки различных размеров (обычно 20X10, 20X20
или 40x20 см), на которые наносят слой сефадекса G-75 ("суперфайн")
толщиной 0,6-1,0 мм для аналитического или толщиной 2 мм - для по-
лупрепаративного разделения. Нанесенный влажный слой геля, содержащего
амфолины в концентрации 1%, высушивают на воздухе до такой консистенции,
при которой он перестает
184
Глава 3
"сползать" при наклоне пластины под углом 45°. Это соответствует потере
около 25% всей воды, содержащейся в исходной суспензии геля. Образец, как
правило, наносят в середину слоя или ближе к аноду в виде смоченной
анализируемым раствором полоски фильтровальной бумаги или непосредственно
на поверхность геля в виде капли или полосы раствора. Готовую пластину
помещают на поверхность блока охлаждения прибора типа "двойной камеры"
производства фирмы Desaga. Электрическое поле прикладывают через плоские
угольные электроды, которые прижимают к полоскам толстой фильтровальной
бумаги (типа MN 866 с поверхностной плотностью 650 г/м2, производства
западногерманской фирмы Machery, Nagel and Co., Duren, West Germany),
