Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Ригетти П. -> "Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение" -> 65

Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.

Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение — М.: Мир, 1986. — 399 c.
Скачать (прямая ссылка): izoelektricheskoefokusirovanie1986.djvu
Предыдущая << 1 .. 59 60 61 62 63 64 < 65 > 66 67 68 69 70 71 .. 171 >> Следующая

холодной водой. После окончания ИЭФ анод удаляют и в разделительное
колено до самого дна погружают трубку сифона. С помощью сифона содержимое
колонки раскапывают по пробиркам.
Аналогичная система для быстрого ИЭФ многочисленных образцов на уровне
микроколичеств была предложена Godson, 1970. В этой системе
фракционирование проводится в стеклянной, так называемой J-образной
трубке (рис. 3.1) с наружным
Аналитическое ИЭФ
диаметром 1,1 см, внутренним диаметром 0,9 см'и полным объемом 10 мл. J-
образные трубки по размеру подходят к обычному аппарату для электрофореза
в цилиндрических гелях. Одновременно можно проводить ИЭФ в восьми
отдельных трубках. Более длинное колено трубки (25 см) содержит
сахарозный градиент плотности и функционирует как разделительная колонка.
В коротком колене (16 см) находится "подушка" тяжелого электродного
раствора; в верхней его части располагается электрод (как правило,
катод). Почти вся трубка погружена в охлаждаемую посредством внешней
рубашки нижнюю камеру прибора, заполненную электролитом, который
перемешивается с
А
Рис. 3.1. J-образные трубки для ИЭФ с использованием обычного аппарата
для электрофореза в цилиндрических гелях. А. Размеры J-образной трубки и
устройство системы элюции. 1 - съемная насадка для элюции, 2 - тонкий
шланг к коллектору фракций, 3 - притертые поверхности контакта. Б. Трубки
в рабочем положении. 1-легкий анолит, 2 - раствор электролита (H2SO4), 3
- тяжелый католит, 4 - раствор электролита, 5 - магнитная мешалка, 6 -
амфолины (градиент pH). (Godson, 1970.)
11-1488
162
Глава 3
помощью магнитной мешалки. Верхние концы длинного и короткого колен J-
образной трубки (анолит и католит) соединяются с электролитом,
заполняющим верхнюю и нижнюю камеры соответственно, с помощью коротких
петель из платиновой проволоки. По окончании ИЭФ к разделительному колену
трубки присоединяют коническую стеклянную насадку. Через нее содержимое
колонки постепенно вытесняют, подавая в малое колено концентрированный
раствор сахарозы, и раскапывают по фракциям? Аналогичные системы ИЭФ с
использованием J-об-разных трубок описаны также в работе Koch, Backx,
1969.
В последние несколько лет в группе Рильбе шла разработка систем для ИЭФ в
маленьких ячейках с очень крутым градиентом плотности и высокостабильным
градиентом pH. Была описана кварцевая ячейка в форме параллелепипеда
длиной 14 см и объемом 11,2 мл (Rilbe, 1970). Фокусирование в ней
продолжается всего 6-7 ч, но стоимость укомплектованной ячейки непомерно
высока. В поисках более доступного оборудования Рильбе и его сотрудники
обнаружили, что обычная проточная термостатируемая спектрофотометрическая
кювета может быть легко превращена в хорошую колонку для ИЭФ. В работах
Rilbe, 1973 b, Jonsson et al., 1973, сообщается об использовании для ИЭФ
проточной кюветы типа 167-QI производства западно-германской фирмы Hellma
GMBH (Mullheim, Baden, West Germany). Центральное отделение кюветы
является собственно разделительной колонкой; ее размеры 4Х 10X35 мм и
объем 1,4 мл. Поскольку ИЭФ проводится в очень малом объеме, весь процесс
занимает всего 2,5 ч, включая время, необходимое для приготовления
градиента плотности и сканирования. Фокусирование протекает
непосредственно в спектрофотометре, поэтому для сканирования градиента во
время или после ИЭФ достаточно установить соответствующее подъемное
устройство и фиксированную горизонтальную щель. Для своей работы Рильбе
использовал спектрофотометр марки Vitatron Universal Photometer. Помимо
сканирования в конструкциях такого типа можно снимать и спектры
поглощения отдельных белковых зон. Это позволяет изучать химические
превращения белков при воздействии каких-либо ионизированных реагентов,
мигрирующих по колонке, в которой предварительно были сфокусированы
исследуемые белки. Так, удавалось наблюдать за восстановлением
сфокусированного метмиоглобина кашалота до миоглобина под влиянием
небольших количеств дитионата натрия, инъецированного в колонку со
стороны катода (Rilbe, 1973 b). Последующее добавление небольшого
количества феррицианида калия, также со стороны катода, вызывало обратный
переход миоглобина в окисленную Ре3+-форму. Об этих превращениях судили
по соответствующим изменениям в характерных спект-
Аналитическое ИЭФ
163
pax поглощения обеих форм белка. Казалось бы, определение pH-профиля в
такой микроколонке является почти невыполнимой задачей. Тем не менее в
работе Fredriksson, 1972. описан метод микрофракционирования содержимого
проточной кюветы после ИЭФ, позволяющей получать фракции объемом 60 мкл.
Для измерения pH во фракциях использовалась микроэлектрод-ная ячейка
Е5021 (датской фирмы Radiometer, Copenhagen, Denmark). В этой ячейке
стеклянная pH-чувствительная мембрана сделана в виде горизонтального
капилляра, который заполняется жидкостью, засасываемой через вертикальную
полиэтиленовую трубочку. Для определения pH достаточно всего лишь 20 мкл
Предыдущая << 1 .. 59 60 61 62 63 64 < 65 > 66 67 68 69 70 71 .. 171 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed