Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
содержащих только продукты полимеризации "сшивки") макромолекулы могут
мигрировать в свободном пространстве между гранулами или компактными
агрегатами, из которых построена матрица таких гелей. Таким образом, как
бы парадоксально это ни звучало, высокосшитые гели по свойствам
напоминают гель-фильтрационные системы. Как показано в работе Righetti et
al., 1981b, в гелях с С = 50-60% размер пор достигает 500-600 нм, что
делает такие гели особенно привлекательными для изоэлектрического
фракционирования. Однако по ряду причин их практическая ценность
оказывается весьма ограниченной. Во-первых, гели этого типа очень
непрочны и (при С>50%) абсолютно неэластичны. Это значит, что практически
можно работать только с горизонтальными тонкими пластинами геля,
ковалентно "пришитого" к стеклянной подложке с по-
176
Глава 3
мощью силанольных мостиков (Bianchi Bosisio et al., 1980). Bo-вторых, при
Сбис>30% гель становится гидрофобным, стремится отторгнуть воду и со
временем разрушается. Наблюдаемая гидрофобность связана не только с
повышенным содержанием биса, поскольку аналогичные явления наблюдаются и
для гелей, основанных на использовании более гидрофильной "сшивки" -
N,N'- (1,2-дигидроксиэтилен) бисакриламида (Д ГЭБА).
Причина скорее заключается в том, что высокая плотность "сшивки"
препятствует набуханию матрицы в растворителе. По-видимому, оказывается,
что контакты полимер-полимер становятся выгоднее, чем контакты полимер-
растворитель. Удачным компромиссным вариантом можно считать гели с 30%
С6кс или 40% СДПЖА1, которые характеризуются относительно крупными порами
(200-250 нм) и в то же время приемлемы с точки зрения механических
свойств и склонности к набуханию.
Разнообразие, полиакриламидных гелей иллюстрирует тот факт, что помимо
биса в качестве "сшивки" могут быть использованы другие химические
реагенты для получения гелей с определенными свойствами, продиктованными
потребностями конкретной системы фракционирования. Эти реагенты
перечислены в табл. 3.1. Для приготовления "обратимых" разжижаемых гелей
используется ДГЭБА (O'Connel, Brady, 1976), поскольку его 1,2-диольная
группировка легко подвергается окислительному расщеплению йодной
кислотой. На том же принципе основано применение ДАТД (Anker, 1970).
Расщеплению другого типа подвергаются гели на основе ЭДА (Paus, 1971); в
этом случае "сшивка" содержит эфирную группировку, которая гидролизуется
в щелочной среде (основный катализ). К той же серии эфирных производных
принадлежат "сшивки" на основе поли-(этиленгликоль)-диакрилатов (Righetti
et al., 1981b). Еще один вариант "сшивки", поддающейся расщеплению, - это
БАЦ, содержащий дисульфидную группу, которая может быть восстановлена под
действием тиолсодержащих агентов (Hansen, 1976; Hansen et al., 1980).
Гели, получаемые на основе БАЦ, особенно полезны при фракционировании РНК
- только эти гели легко разжижаются в мягких, почти физиологических
условиях. Большинство перечисленных в таблице реагентов успешно
применяются для приготовления полиакриламидных гелей, за исключением ДАТД
и ТАЦТ: оба этих реагента являются аллильными производными и подавляют
полимеризацию. Использовать их при высоких значениях С попросту
невозможно (Gelfi, Righetti, 1981а,b; Bianchi Bosisio et al., 1980).
3.2.4. ИЭФ в тонких агарозных пластинах
Агароза, пригодная для ИЭФ, в-настоящее время поставляется фирмой Marine
Colloids (FMC Corp., Rockland, ME) с тор-
Аналитическое ИЭФ
177
говым названием Isogel agarose, фирмой LKB Produkter АВ- agarose EF и
фирмой Pharmacia - agarose IEF. Способ получения двух первых марок
агарозы держится в секрете. Про последнюю известно, что суть процесса
сводится к компенсации суммарного отрицательного заряда полисахаридной
матрицы (обусловленного главным образом сульфогруппами) с помощью
ковалентной "посадки" на матрицу эквивалентного числа положительно
заряженных групп. Подобный процесс был уже описан ранее (Grubb, 1973;
Ragetli, Weintraub, 1966). Впрочем, весьма вероятно, что фирма Pharmacia
для модификации агарозы использует более сильные, четвертичные
аммониевые, основания, для которых значения рК лежат за пределами обычных
рабочих диапазонов pH при ИЭФ. Рабочие характеристики агарозы марки IEF
были независимо изучены в работах Rosen et al., 1979а,b; Rosen, 1980, и в
работах Saravis et al., 1979, 1980a,b; Saravis, Zamcheck, 1979.
Сообщалось об очень высоком разрешении при ИЭФ с использованием этой
агарозной матрицы таких высокомолекулярных белков, как аг-макроглобулин
(Afr 780 000), 19 различных иммуноглобулинов М (Ig М,
Мт 900 000), гемоцианина из моллюска Fissurella (Мт 3-106) и цинк-
глицинатного маркера опухолей человека (Мт 2-106). Помимо значительно
большего размера пор у агарозной матрицы есть и другие важные
преимущества по сравнению с матрицами типа полиакриламида: (а) она не
токсична, тогда как акрила-мид и бис являются нейротоксинами; (б)
гелеобразование происходит без участия каких-либо катализаторов, которые
