Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
смоченным 1 M серной кислотой (анод) и 2 М этилендиамином (катод)
(Radola, 1969, 1973а,Ь, 1975). После ИЭФ белковые зоны регистрируют
методом реплики на листе фильтровальной бумаги (типа MN 827,
поверхностная плотность 270 г/м2; Machery, Nagel and Co.), который
аккуратно накладывают на поверхность слоя. Для окраски реплики пользуются
одним из следующих красителей: Light Green SF, Coomassie Brilliant Blue
R-250, Coomassie Violet R-150 или Coomassie Brilliant Blue G-250.
В одном из вариантов метода в исходную суспензию сефадекса добавляют
также акриламид и сшивающий агент (Ziegler, Kohler, 1976). После ИЭФ в
таком слое проводят его полимеризацию, опрыскивая концентрированным
буферным раствором, содержащим соответствующие катализаторы. Преимущества
этого метода заключаются, с одной стороны, в устранении сте-рических
препятствий при фокусировании очень крупных молекул, а с другой - в
облегчении процедуры регистрации зон в полимерном геле. Впрочем,
существует опасность, что в процессе ИЭФ, особенно в щелочной области,
белки будут реагировать с акриламидными мономерами.
Помимо сефадекса для ИЭФ могут быть использованы и другие гранулированные
гели, например на основе полиакриламида (биогель Р) и даже пластика
(Pevikon С-870; Harpel, Kueppers, 1980). В последнем варианте пластиковые
гранулы приходится смешивать с каким-либо гидрофильным полимером,
поскольку сами они не связывают воду. При работе со слоем из чистого
пластика недопустимо высоким оказалось бы электрическое сопротивление
слоя.
5.2.7. ИЭФ в полиакриламидных гелях
Сообщения о разработке нового аналитического варианта ИЭФ в
полиакриламидном геле и о его преимуществах по сравнению с жидкостным ИЭФ
появились независимо и практиче-
Аналитическое ИЭФ
185
ски одновременно в целом ряде публикаций (Awdeh et al., 1968; Dale,
Latner, 1968; Fawcett, 1968; Leaback, Rutter, 1968; Riley, Coleman, 1968;
Wrigley, 1968a,b; Catsimpoolas, 1969a). Эти работы сразу же
продемонстрировали уникальные возможности нового метода. Однако в тот
период, когда совершался переход от жидкостного ИЭФ к ИЭФ в геле,
практически не было проведено систематических исследований по оптимизации
таких факторов, как состав геля и электрические условия ИЭФ. Почти все
первые системы ИЭФ в геле, особенно основанные на использовании трубок,
отличались нестабильностью градиента pH ("катодный дрейф" по Righetti,
Drysdale, 1971, или "эффект плато" - по Finlayson, Chrambach, 1971), что
заметно ограничивало их применимость. Можно сказать, что на первых этапах
существования ИЭФ в геле едва ли кому-нибудь удавалось добиться получения
истинно стационарных условий и достаточно стабильного градиента pH, в
котором макромолекулы могли бы сфокусироваться при истинных значениях
своих pi. На сегодняшний день развитие метода шагнуло достаточно далеко,
чтобы в большинстве случаев обеспечить получение стабильных белковых зон,
достигающих равновесного положения (pi) задолго до начала заметной
дестабилизации градиента pH. Более того, с появлением революционного
метода, основанного на использовании иммобилизованных (или "пришитых")
градиентов pH (разд, 1.11.7), проблема "катодного дрейфа" полностью
снимается. Иммобилизованные градиенты pH практически абсолютно стабильны,
и миграции белковых зон от своих значений pi не наблюдается. Исходя из
отмеченных факторов, а также из общеизвестной универсальности
полиакриламидных гелей (которые можно приготовить как с узкими, так и с
широкими порами, в виде цилиндрических столбиков, пластин или ультратон-
ких слоев, а также при необходимости легко подвергать разжижению по
окончании фракционирования), можно сказать, что возможности этих гелей
далеко не исчерпаны. Не приходится сомневаться, что они и в дальнейшем
будут широко использоваться в большинстве вариантов метода
изоэлектрического фракционирования.
3.2.8. Состав геля
Выбор геля соответствующего состава - это один из ключевых моментов
метода ИЭФ в ПААГ. Особое значение имеют два параметра - пористость и
концентрация амфолитов в геле. Желательно использовать гели с
максимальной пористостью и вместе с тем обладающие достаточной
механической прочностью. Оба этих свойства зависят от относительного
содержания акри-
186
Глава 3
ламида и "сшивки", которое обычно выражают с помощью следующих параметров
(Hjerten, 1962):
Т (о/ \ _ (акриламид + сшивка) г ^ ' 100 мл раствора
С (%) = ------(сшшшОг 00
/ (акриламид + сшивка) г
Минимальное-содержание акриламида, при котором образуется гель, пригодный
для ИЭФ, соответствует значениям параметров 7'=3%, С = 4% (бис). Однако
гели с таким составом отличаются чрезвычайной мягкостью и липкостью. В
большинстве случаев удовлетворительные результаты удается получить при
ИЭФ в гелях состава Т=5%, С = 3% (Vesterberg, 1971b) и 7 = 4%, С=4%
(Righetti, Drysdale,, 1971). В таких гелях можно проводить ИЭФ белков с
мол. массой вплоть до 1,5 • 10б, хотя для наиболее крупных белков (в
