Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
5-6 PBE 94 25 мМ гистидин-HCl, Полибуфер 74 - HC1
pH 6,2 pH 5,0
4-5 PBE 94 25 мМ пиперазин-HCl, Полибуфер 74-HC1
pH 5,5 pH 4,0
1 Chromatofocusing with polybuffer and РВЕ Pharmacia Fine Chemicals,
November 1980.
156
Глава 2
1980; Emond, Page, 1980; Francina et al., 1981). При ABX элю-ция с
обычных ионообменников проводится с помощью раствора амфолитов-носителей.
Однако, поскольку ионообменник уравновешен при pH, равном pH элюента, нет
никаких оснований ожидать, что образуется хоть какой-то градиент pH.
Механизм' элюции при АВХ неизвестен, но полагают, что он основан на
конкуренции между белками и амфолитами за связывание с заряженными
группами матрицы. Поскольку градиент pH не образуется, белки при АВХ
элюируются не всегда строго в порядке изменения их pi. В отличие от
хроматофокусирования при-АВХ не наблюдается никакого фокусирующего
эффекта. Кроме того, для элюции приходится использовать высокие
концентрации амфолитов (около 60 г/л). В то же время при
хроматофокусировании элюция происходит главным образом вследствие
изменения заряда белка, а не из-за "вытеснения", и поэтому концентрация
амфолитов в элюенте может быть значительно ниже (порядка Юг/л).
Помимо двух рассмотренных хроматографических методов применяется еще и
так называемая "изоэлектрическая хроматография" (Petrilli et al., 1977).
Этот термин был использован-применительно к двухстадийной
последовательной ионообменной хроматографии (на анионообменнике и
катионообменнике); при pH, равном pi выделяемого компонента. Очистка
достигается благодаря тому, что в отличие от не сорбирующегося в этих
условиях искомого компонента все более кислые и более щелочные примеси
задерживаются на анионите или катионите соответственно. Следует отметить,
что разрешающая способность этого метода невысока. Достигается разделение
белков, изоточки которых различаются на 0,2-0,3 ед. pH (при
хроматофокусировании эта величина составляет 0,05 ед. pH).
2.2.8. Заключительные замечания. О максимальной загрузке образцом
В этом кратком обзоре мы воздали должное изобретательности
экспериментаторов, направивших свои усилия на создание и
усовершенствование устройств, наиболее эффективно использующих уникальную
разрешающую способность метода ИЭФ как для аналитического, так и для
препаративного фракционирования. Сведения о других возможных вариантах
конструирования простых и эффективных систем препаративного ИЭФ можно
почерпнуть из прекрасной статьи Fawcett, 1975а.
Как мы уже знаем, некоторые из методов препаративного' ИЭФ позволяют
фракционировать очень большие количества белка, на уровне нескольких
граммов препарата. С другой стороны, всегда считалось, что при ИЭФ в
сахарозном градиенте
Препаративное ИЭФ
15Т
плотности загрузка по белку должна быть весьма ограниченной. Так, в 440-
мл колонке фирмы LKB не рекомендуется фракционировать более чем несколько
сот миллиграммов белка. Однако мне кажется, что в свете теоретических
выкладок Rilbe, Petters-son, 1975 (разд. 1.3.8), эту точку зрения следует
пересмотреть. Согласно этим авторам, при ИЭФ в линейном градиенте
плотности раствора сахарозы теоретически допустимое содержание-белка в
зоне (т) определяется следующим неравенством:
/л<0,625V/-2 (г/см3),
где V - полный объем колонки, a t - ширина зоны. Для колонки объемом 100
мл это означает, что
m<62,5r2 (г).
Таким'образом, максимальная загрузка возрастает пропорционально квадрату
ширины зоны, что и было показано экспериментально (Rilbe, Pettersson,
1975). Судя по приведенному выше неравенству, в колонке объемом 110 мл
при значению т = 0,125 см максимальное содержание белка в зоне может
достигать 1074 мг. При работе с миоглобином авторы наносили 1050 мг, а в
основном пике (МЫ) обнаруживали около 800 мг белка, что соответствует 76%
от нанесенного вещества и 74% от величины теоретического максимума. В
работе Janson, 1972, сообщалось о фракционировании 7,3 г
цитоплазматического экстракта Cytophaga johnsonii в колонке объемом 440
мл с сахарозным градиентом плотности. С использованием амфолинов узкого
диапазона pH 6,3-7,3 в колонке объемом 110 мл проводили ИЭФ до 1 г белка
из гемолизатов эритроцитов (Fawcett,. 1975 а). При очистке
стафилококкового а-токсина на колонку с градиентом плотности наносили 1,8
г белка (Goode, Balwin,
1973), а при работе с а-токсином Clostridium perfringens - даже 3,87 г
белка. В работе Jonsson, Rilbe, 1980, авторы в своем гигантском
многокамерном электролизере фракционировали 15 г неочищенного препарата
пепсина и 13,8 г бычьего сывороточного белка. В расчете на одну белковую
зону загрузка-по гемоглобину достигала 7 г. Названные величины
сопоставимы с допустимой загрузкой при ИЭФ в гранулированных гелях.
Однако при работе с такими большими количествами белков-весьма вероятно
выпадение осадка: Поэтому при ИЭФ в вертикальном градиенте плотности
высокая загрузка допустима только в том случае, если искомый белок
образует зону, достаточно удаленную от области интенсивной преципитации
