Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
настоящее время фирмой Desaga, Heidelberg, ФРГ.
Для локализации белков после фокусирования применяют метод бумажной
реплики (Radola, 1973 а). При снятии реплики небольшое количество всех
сфокусированных белков переходит с поверхности геля на полоску
фильтровальной бумаги, которую затем просушивают при 110РС. После
вымывания амфолитов раствором кислоты белковые зоны на реплике можно
обнаружить с помощью низкочувствительных красителей типа "светло-зеленый
SF" или "кумасси фиолетовый R-150".
При использовании кварцевой подложки белки можно обнаруживать прямо в
геле по пропусканию света при 270-280 нм. Для измерения градиента pH в
геле используют комбинированный микроэлектрод, скользящий по
калиброванному шаблону. Преимущества метода Радолы заключаются в
сочетании высокой разрешающей способности, высокой допустимой загрузки
образцом и простоты извлечения сфокусированных компонентов. В широком
градиенте pH можно фракционировать до 5-10 мг белка на 1 мл суспензии.
Сообщалось о разделении 10 г прона-зы Е в 800 мл суспензии геля, которое,
несмотря на очень высокую загрузку, сопровождалось хорошим разрешением
компонентов. При таком высоком содержании белка даже неокрашенные
сфокусированные компоненты легко обнаружить в слое геля визуально; они
имеют вид полупрозрачных зон. При элюции из геля белки выходят в
небольшом объеме с достаточно высокой концентрацией. Отсутствие сахарозы
облегчает последующее отделение белков от амфолитов-носителей.
Поскольку на поведении макромолекул, размер которых превышает предел
эксклюзии сефадекса, молекулярно-ситовые эффекты не влияют, этим методом
можно беспрепятственно проводить ИЭФ очень высокомолекулярных
компонентов, в том числе и таких, как вирусные частицы. Конструктивная
гибкость системы позволяет использовать одну и ту же рамку для
аналитического, полупрепаративного и препаративного ИЭФ, варьируя только
толщину слоя. Если нет возможности тестировать биологическую активность
разделяемых компонентов методом бумажных реплик, то, как правило,
приходится разделять гель
Препаративное ИЭФ
ИЗ
на сегменты, элюировать содержимое всех сегментов и определять активность
в элюатах. Это достаточно трудоемкая процедура. Другой подход к ИЭФ в
гранулированных гелях, позволяющий проводить полуавтоматический сбор
фракций, был предложен в работе Fawcett, 1975 а. Вместо плоского слоя
автор использовал вертикальную стеклянную колонку, аналогичную той,
которая была описана Brakke et al., 1968, заполненную суспензией
гранулированного геля. После ИЭФ из колонки удаляют слой верхнего
электролита и с помощью тяжелого раствора сахарозы суспензию сефадекса
вытесняют через верх колонки и подают на специальный коллектор фракций.
Коллектор автоматически отбирает аликвоту суспензии геля и элюирует ее
содержимое через фильтр в очередную пробирку. Таким способом удавалось
получать фракции, соответствующие участку. столба геля высотой всего 3 мм
без значительного искажения сфокусированных зон.
Как уже отмечалось, метод, предложенный Радолой, замечателен по своей
простоте, гибкости, высокой разрешающей способности и допустимой загрузке
препаратом. Однако, несмотря на то что метод был впервые описан еще в
1969 г., он не получил широкого признания у экспериментаторов. Главный
его недостаток заключался в нестабильности градиента pH и часто
наблюдавшемся искажении сфокусированных зон. Считалось, что это может
быть связано с наличием свободных карбоксильных групп на матрице
сефадекса, которые было предложено блокировать обработкой окисью
пропилена (Radola, 1973а). Проблема нестабильности градиента была
тщательно изучена в работах Winters et al., 1975, и Winters, 1977,
благодаря которым удалось устранить большую часть недостатков метода.
Авторы, в частности, выделили три основных момента в методике
приготовления слоя: (1) сефадекс должен быть предварительно хорошо отмыт;
(2) следует использовать сефадексы категории "су-перфайн", при этом для
получения бумажных реплик лучше работать с сефадексом G-75; (3)
необходимо тщательно контролировать содержание воды в готовом слое. В
пересушенном слое геля часто образуются микротрещины, а в слишком влажном
слое белки имеют тенденцию оседать в нижнем слое геля. Предварительное
промывание сефадекса имеет очень большое зна-1 ение, поскольку препараты
сефадексов, как правило, содержат большое количество низкомолекулярных
заряженных примесей,
; оторые мешают образованию градиента pH. Большую часть этих примесей
удается удалить, промывая набухший сефадекс дистиллированной водой на
воронке Бюхнера. Затем воду из геля вытесняют этанолом и сушат гель под
вакуумом. В настоящее время очищенный сефадекс поставляется фирмой LKB
под маркой Ultrodex. В работе Winters et al., 1975, была опи-
144
Глава 2
Рис. 2.24. Рамка (А), устройство для нанесения образца (Б) и
"фракционирующая решетка" (S) для препаративного ИЭФ в гранулированных
гелях с использованием аппарата Multiphor (LKB 2117). После ИЭФ опускают
