Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
сополимеризации винилхлорида и винилацетата (см. также разд. 1.9). Этот
полимер образует весьма прочный слой, из которого с высокой точностью
можно вырезать необходимые сегменты. Слой хорошо удерживает жидкость. Его
можно получить просто осаждением из суспензии или с помощью устройств,
применяемых для изготовления тонкослойных пластинок. После ИЭФ, которое в
этом случае практически не сопровождается эндосмосом, белки извлекают с
помощью центрифугирования через крупнопористый фильтр. Применение
певикона, по всей видимости, перспективно как для препаративного, так и
для аналитического варианта фракционирования.
2.2.4. ИЭФ в многофазных колонках
Применение вертикальных колонок нового типа для многофазного ИЭФ было
впервые описано в работе Stathakos, 1975. В основе метода лежит принцип,
в какой-то мере аналогичный принципу действия многокамерного
электролизера, который был рассмотрен в работе Rilbe et al., 1975.
Колонка монтируется из блоков, в которых находятся отдельные
цилиндрические сегменты геля, заключенные между промежуточными слоями
жидкости. В верхнем и в нижнем концах колонки расположены электродные
отсеки. Число монтируемых блоков может быть больше или меньше в
зависимости от конкретной задачи. Схематическое изображение колонки,
составленной из шести одинаковых разделительных отсеков, приведено на
рис. 2.25. Колонки этого типа обладают богатыми и разнообразными
экспериментальными возможностями. Образцы можно вносить практически в
любой участок колонки - в верхнюю часть, в любой промежуточный слой
жидкости (высотой 2,5 мм) между соседними блоками или во внутреннее
пространство одного или нескольких блоков. В любой момент времени можно
проконтролировать pH в любом промежуточном слое жидкости. Пространство
между соседними блоками, внутри которого заключена жидкость, образует как
бы отдельную камеру со своим входом и выходом. Для
Препаративное ИЭФ
147
Рис. 2.25. Вертикальное сечение установки для ИЭФ в многофазной колонке,
состоящей из шести последовательно смонтированных блоков. Aj-Ае - 6
отдельных сегментов геля, расположенных в соответствующих блоках.
Устройство каждого блока: ai - трубчатый корпус, а2 - поддерживающая
мембрана, а3 -кольцевая прокладка из силиконовой резины, а* - крепежное
кольцо, а5 - стеклянная пробка, ае - пластиковый кожух, а7 - выходной
отросток. Б - верхняя электродная камера, В - верхний электрод, Г - винт-
регулятор подъема электрода, Д - металлические опорные стержни, Е -
верхняя панель, Ej - винт крепления панели, Ж - нижняя электродная
камера, 3 - цилиндрическое основание колонки, И - нижний электрод, К -
наклонный канал, ведущий к вспомогательной уравновешивающей трубке Л, Л'
- дополнительная насадка, М - канал для отвода электролизных газов.
(Stathakos,
1975.)
148
Глава 2
Рис. 2.26. Выделение гипотетического белка с р I=6,7 по методу
"каскадного" ИЭФ с переходом от крутого к более пологим градиентам pH.
(Stathakos,
1980.)
определения pH можно просто отобрать несколько микролитров жидкости из
такой камеры или же выкачать все ее содержимое, измерить pH и закачать
обратно. Поскольку пористость геля в каждом блоке можно варьировать
независимо, дополнительной очистки искомых белков можно добиться,
подбирая пористость в сегментах, находящихся на пути разделения, так,
чтобы избирательно задерживать те или иные компоненты смеси. Белки,
сфокусированные в одном из сегментов, можно подвергнуть дальнейшему
фракционированию в более пологом градиенте pH. Для этого достаточно
извлечь соответствующий блок и вмонтировать его в другую колонку. Эту
операцию можно повторить несколько раз, т. е. вести разделение по
принципу "взрыва" или "каскада" до тех пор, пока не будет достигнуто
состояние "один гель-один белок" (рис. 2.26; Stathakos et al., 1980). В
конце концов очищенный белок можно извлечь из геля с помощью
электроэлюции с одновременной очисткой от амфолинов так, как описано в
работе Suzuki et al., 1973 (см. разд. 4.6).
2.2.5. ИЭФ в цилиндрических полиакриламидных гелях
Имея в виду хорошую разрешающую способность и высокую допустимую загрузку
при ИЭФ в цилиндрических полиакриламидных гелях, мы приспособили обычный
прибор для аналитического ИЭФ в трубках для препаративного
фракционирования (Righetti, Drysdale, 1973). Для этого оказалось
достаточно заменить центральный блок прибора на аналогичный блок, рассчи-
Препаративное ИЭФ
14"
тайный на трубки большего размера. Трубки закрепляются в соответствующих
гнездах с резиновыми прокладками, между двух параллельных дисков,
образующих герметичный центральный отсек. В этом отсеке циркулирует
охлаждающая жидкость с температурой 1°С. Кольцевые платиновые электроды
расположены в верхнем и нижнем отсеках, близко к концам трубок, для
сведения к минимуму выхода амфолитов из геля и подавления катодного
дрейфа градиента pH. В препаративном варианте прибор содержит 6 трубок с
гелем - 3 трубки объемом по 50 мл {диаметр 2 см), 2 - по 20 мл (диаметр
