Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Ригетти П. -> "Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение" -> 62

Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.

Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение — М.: Мир, 1986. — 399 c.
Скачать (прямая ссылка): izoelektricheskoefokusirovanie1986.djvu
Предыдущая << 1 .. 56 57 58 59 60 61 < 62 > 63 64 65 66 67 68 .. 171 >> Следующая

мигрируют с большей скоростью, чем молекулы во фронтальной части зоны.
Если на колонку нанести вторую порцию раствора того же белка, то она
может догнать первую и обе они выйдут из колонки в виде общей зоны. Если
дополнительно нанести порцию раствора другого белка, с более высоким
значением pi, то этот белок может обогнать зону первого белка и выйти из
колонки раньше его.
(С любезного разрешения Pharmacia Fine Chemicals.)
154
Глава 2
переменная сорбция и десорбция белка происходят вплоть до его выхода из
колонки при pH, равном pi.
Сущность фокусирующего эффекта при хроматофокусировании проиллюстрирована
на рис. 2.29. После нанесения белка на колонку он мигрирует быстро вместе
с элюентом до тех пор, пока не попадает в область градиента pH,
соответствующую его pi. Начиная с этого момента и вплоть до выхода из
колонки белковая зона мигрирует с меньшей скоростью. Если по ходу
процесса на колонку нанести вторую аликвоту того же образца, то вторая
белковая зона будет продвигаться с фронтом элюен-та, пока не догонит
первую, медленно мигрирующую зону. После этого зоны сливаются и далее
движутся по колонке и элюируются в виде одной общей зоны.
Для проведения хроматофокусирования в лабораторных условиях можно
пользоваться буферными смесями и ионообмен-никами, которые предлагает
фирма Pharmacia. Специальный ионообменник, называемый полибуферным
обменником (Polybuffer exchanger) марки РВЕ 94, применяется для
хроматофокусирования в сочетании с буферными смесями - полибуфером 96
(рабочий диапазон pH 9-6) и полибуфером 74 (рабочий диапазон pH 7-4). Для
работы в более щелочной области используют обменник РВЕ 118, ав качестве
элюента - фармали-ты pH 8-10,5.
Что представляют собой эти буферы и обменники? Нет сомнений, что в состав
полибуферов 96 и 74 входят амфолиты-но-сители соответствующих диапазонов
pH, предназначенные для разделения белков, изоточки которых лежат внутри
этих диапазонов. Ионообменники содержат функциональные группы с буферными
свойствами в области pH 4-9 (РВЕ.94) или pH 8-И (РВЕ 118). Эти группы
ковалентно "пришиты" к полисахаридной матрице сефарозы 6 В. Разница между
обменниками для хроматофокусирования и обычными ионообменниками
заключается в том, что первые содержат одновременно несколько тцпов
буферных групп с различными значениями рК. В обычных ионо-обменниках
присутствуют буферные группы только одного типа с определенным значение
рК (например, с рК 9,5 для ДЭАЭ-сефадекса или с р/С 4,5 для КМ-
сефадекса).
Для того, чтобы в колонке мог сформироваться стабильный градиент pH,
необходимо, чтобы совокупность иммобилизованных на матрице функциональных
групп по буферной емкости во всем рабочем диапазоне pH была сопоставима с
амфолитами, которые используются для элюции. И на самом деле, обменник
РВЕ 94 характеризуется практически постоянной хорошей буферной емкостью в
диапазоне pH 4-9 (в среднем около 3-3,5 мэкв. на 100 мл геля на 1 ед.
pH), а РВЕ 118 - еще более высокой буферной емкостью при pH 8-11 (около
4-4,5 мэкв. на
Препаративное ИЭФ______________________________155
100 мл на 1 ед. pH). Не исключено, что обменник РВЕ 118 синтезируется по
методу Sluyterman, Wijdenes, 1981 b, присоединением полиэтиленимина (ПЭИ)
к сефарозе 6 В через бисоксира-новый мостик. В щелочной области pH ПЭИ
практически полностью депротонирован (см. также Righetti, HjertSn, 1981),
поэтому слабые иминогруппы обменника модифицируют. О-ме-тилизомочевиной
для получения сильно основных гуанидиновых групп. О структуре обменника
РВЕ 94 почти ничего не известно. Обменник такого типа можно было бы
получить иммобилизацией на сефарозе 6 В смеси олигоаминов типа ТЭТА, ТЭПА
и ПЭГА (разд. 1.7.1).
В табл. 2.4 приведены рекомендации по выбору обменника, •исходного буфера
и элюирующего буфера для хроматофокуси-рования в различных диапазонах pH.
Недавно был описан еще один вариант хроматофокусирова-ния, в котором для
получения подвижного градиента pH использовали смесь обычных амфотерных и
неамфотерных буферов (Hearn, Lyttle, 1981).
В отличие от хроматофокусирования сущность метода "ам-фолит-
вытеснительной хроматографии" (АВХ, в оригинале - "ampholyte displacement
chromatography", или ADC) далеко не так понятна. Теория метода не
разработана! Тем не менее фракционирование с помощью АВХ, впервые
описанное Leaback, & Robinson, 1975, было впоследствии успешно
использовано и в ряде других работ (Young, Webb, 1978 a, b; Young et al.,
1978; Young, Webb, 1980; Page, Belles-Isles, 1978; Chapius-Cellier et
al.,
Таблица 2.4 Буферные растворы и обменники для хроматофокусирования в
различных диапазонах pH1
Диапазон pH Обменник
Исходный буфер
Элюент
9-10,5 PBE 118 25 мМ триэтиламин-HCl, Фармалиты pH 8-10,5-
pH 11 HC1 pH 9,0
8-9 PBE 94 25 мМ этаноламин-HCl, Фармалиты pH 8-10,5 -
pH 9,4 HC1 pH 8,0
7-8 PBE 94 25 мМ трис-HCl, pH 8,3 Полибуфер 96 - HC1
pH 7,0
6-7 PBE 94 25 мМ имидазол- Полибуфер 96 -
CH3COOH, pH 7,4 CH3COOH pH 6,0
Предыдущая << 1 .. 56 57 58 59 60 61 < 62 > 63 64 65 66 67 68 .. 171 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed