Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
К заключению о правомерности использования модели двух состояний склоняют также данные прецизионных измерений П.Л. Привалова и Н.Н. Хечинашвили тепловых эффектов (АН) тепловой денатурации метмиоглобина, а-химотрипсина, рибонуклеазы, лизоцима и цитохрома с [39]. Для этих белков отношение АНУАН (AH' — зависящая от принятой модели вант-гоффовская энтальпия) равно 1,05±0,03. Отклонение весьма незначительно, и поэтому денатурацию пяти белков можно рассматривать в первом приближении как кооперативный переход между двумя количественно разными макроскопическими состояниями, при котором промежуточные формы неустойчивы и присутствуют в незначительных количествах. Двухстадийный процесс денатурации, согласно П.Л. Привалову [40] и Т. Крейтону [18], обычно имеет место у однодоменных белков.
Хотя многие данные о денатурации различных белков как будто бы не противоречат теории Брандтса и модели двух состояний, тем не менее это приближение нельзя считать заведомо удовлетворительным при исследовании новых объектов. Не следует также переоценивать значения совпадений экспериментальных и расчетных термодинамических параметров. Нужно не забывать, что подход Брандтса является термодинамическим и, следовательно, феноменологическим и, как таковой, не может дать на основе статистических характеристик деталь-
350
ного описания конкретного механизма денатурации любого белка. Как отмечают Ламри и Билтонен: "Специальный подход с моделями, развитый Брандтсом, является не столько теорией, сколько полуэмпири-ческим методом анализа изменений термодинамических величин во время перехода между двумя состояниями (т.е. строго кооперативного) в белках" [20. С. 71].
Известны случаи прямого, вполне очевидного несоответствия процесса денатурации двухстадийному приближению. Это проявляется, например, у карбоангидразы при ее денатурации гуанидингидрохлори-дом в различном характере экспериментальных кривых и типичных для двухстадийного процесса зависимостей [41]. У стафилококковой пени-циллиназы отклонения от модели Брандтса обнаруживаются в несовпадении характера изменений при денатурации различных физических параметров. Так, если судить по вязкости и УФ-поглощению, белок совершает свой единственный конформационный переход и полностью денатурирует при 0,5 М гуанидингидрохлорида, а согласно спектрам дисперсии оптического вращения (ДОВ), первые конформационные изменения происходят только при 1,5 М концентрации того же дена-туранта. Проводившие эти исследования Б. Робсон и Р. Пейн сделали вывод, что в интервале концентраций 0,5—1,5 М гуанидингидрохлорида в растворе существует в заметном количестве третье промежуточное конформационное состояние белка [42].
Отклонение процесса денатурации от схемы двух состояний может быть не только истинным, но и кажущимся, хотя сделать здесь однозначное отнесение не всегда представляется возможным. Если, например, конформация белка включает несколько доменов, то их развертывание при денатурации может происходить последовательно, в значительной степени независимо и с разной скоростью. Денатурация муль-тисубъединичных белков, имеющих четвертичную структуру, обычно начинается с диссоциации и их последующего развертывания [43, 44]. Усложняют процесс денатурации и затрудняют его интерпретацию также межмолекулярная ассоциация и выпадение в осадок развернутых белковых цепей, что часто происходит в слабоденатурирующей среде. В результате образуется третье состояние белка. Подобным образом ведут себя карбоангидраза и стафилококковая нуклеаза, развертывающиеся при малой концентрации гуанидингидрохлорида и необратимо денатурирующие из-за малой растворимости в этих условиях. Еще одна причина сложности процесса денатурации может заключаться в неоднородности молекулярной организации белка (в присутствии других белков или молекул в ассоциированном состоянии), которая имеет место или с самого начала, или возникает в процессе развертывания. Известным примером такого рода является овальбумин. Сложный характер его перехода N D впервые был отмечен Р. Симпсоном и У. Коз-маном в 1953 г. и в течение более двадцати лет не мог быть объяснен
[45]. Оказалось, что белок состоит из трех фракций, четко разделяемых электрофоретически, содержащих разное число (от 0 до 2) ковалентно связанных фосфатных групп. При исследовании фракций в
351
чистом виде отклонений от двухстадийного процесса не наблюдалось
[46].
Кинетические аспекты. Трудно представить, что белки могут принимать нативную физиологически активную конформацию, сворачиваясь случайным образом по принципу "проб и ошибок". Даже в условиях in vitro самопроизвольная сборка трехмерной структуры белка, не содержащего дисульфидных мостиков, происходит настолько быстро, что дает основание допустить во много раз большую скорость этого же процесса в условиях in vivo по сравнению со скоростью рибосомального матричного синтеза аминокислотной последовательности. Создание за считанные секунды из развернутой полипептидной цепи трехмерной структуры макромолекулы возможно только при высокой степени кооперативное™ процесса. Естественно было ожидать, что кинетика этого процесса будет соответствовать такому механизму ренатурации белка, при котором происходящие на каждом участке последовательности события увеличивают вероятность и, следовательно, скорость последующей укладки всех отдельных участков цепи в направлении правильной нативной конформации. Данному условию удовлетворяет самый простой механизм самоорганизации белков, включающий единственный переход между двумя состояниями (N D). Согласно теории этого процесса, которая только что была рассмотрена, никакие другие состояния белковой цепи, кроме N и D, не присутствуют в экспериментально обнаруживаемых количествах в течение всего времени прямой (N —> D) и обратной (N D) реакций. Если развертывание и свертывание белковой цепи действительно следуют двухстадийному процессу, то изучение кинетики и выяснение деталей конкретного механизма денатурации и ренатурации сталкивается с особенно серьезными трудностями. Они вызваны большими скоростями реакции и малыми концентрациями промежуточных состояний, а это требует быстрореагирующей и высокочувствительном экспериментальной техники. Наиболее часто используются спектральные методы (ЯМР, КД, УФ), ферментативный гидролиз, иммунологические методы. Для быстрой остановки процесса применяются методы стоп-флоу.
