Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
354
вителя первой группы переходы между всеми промежуточными состояниями и обретение белком термодинамически самой стабильной трехмерной структуры достигаются значительно быстрее, чем у представителей второй группы. В этом случае слабее кооперативность процесса структурной самоорганизации и путь к нативной конформации более сложен и длителен.
Дж. Тейпелем и Д. Кошландом было обнаружено, что скорость восстановления структуры белков in vitro больше скорости синтеза полипептидов in vivo, включающего собственно химическую часть и укладку трехмерной структуры [51]. Биологическая активность при рена-турации восстанавливается значительно медленнее, чем при биосинтезе. Авторы предполагают, что свертывание in vivo исключает образование предшественников, которые слишком медленно трансформируются в активный белок.
Г. Эпштейн и соавт. [52] исследовали кинетику свертывания кислой стафилококковой нуклеазы до нативного состояния путем нейтрализации в стоп-флоу спектрофотометре, измеряя флуоресценцию триптофа-новой боковой цепи. Общая кинетическая модель, к которой приходят авторы после анализа полученных данных, сводится к следующей формуле процесса денатурации:
Измерения кинетики свертывания белка в интервале 13—38° позволили обнаружить протекание у него двух процессов, отличающихся друг от друга кинетически и физически. Один из них, более быстрый, не подвержен в исследованной области заметному влиянию температуры, а другой, напротив, существенно зависит от нее. Первый процесс, происходящий в начале свертывания, авторы связывают с образованием зародышевых структурных форм, а следующий за ними процесс — с образованием гидрофобных областей и укладкой белковой цепи в компактную глобулярную форму. Меньшая скорость второго процесса обусловлена большей высотой энтропийного барьера по сравнению с барьером на начальном этапе структурирования цепи.
При исследовании термодинамики и кинетики денатурации рибонуклеазы А Т. Тсонг и соавт. [53] столкнулись с парадоксальной ситуацией, впрочем, уже встречавшейся при изучении денатурации цитохрома с. С одной стороны, термодинамика свертывания белка в нейтральной среде показывает отклонение, а в кислой — близкое соответствие двухфазному процессу (N D). С другой стороны, кинетика развертывания рибонуклеазы А в этих условиях свидетельствует об обратном. Попытка объяснить наблюдаемое несоответствие термодинамических и кинетических данных привела Тсонга и соавторов к разработке так называемой постадийной модели свертывания и развертывания белка, претендующей на обобщение известных фактов о денатурации.
N ¦* ¦—D
X
12*
355
В предложенной модели чувствуется стремление авторов сохранить трактовку этих фактов с позиции теории двух состояний. Развертывание нативной конформации белка, согласно постадийной модели, состоит из двух фаз: начальной и завершающей, которая, в свою очередь, может включать последовательный ряд стадий. Процесс деградации глобулярной нативной конформации до развернутой белковой цепи, на отдельных участках которой имеются зародышевые формы — элементарные структурные элементы белка, отнесен авторами к наиболее высококооперативным. Он проходит за период времени, на несколько порядков меньший по сравнению с последующим периодом разрушения зародышевых нуклеаций. Таким образом, процесс денатурации согласно Тсонгу и соавторам описывается формулой N X D, причем стадия Ni^X является быстрой, а X D — медленной.
Последующее изучение ренатурации рибонуклеазы А Дж. Гарелом и Р. Болдвином привело к еще одному неожиданному результату [54]. Оказалось, что как быстрая, так и медленная стадии этого процесса принадлежат нативной конформации белка, что никак не соответствовало постадийной модели и механизму денатурации с Х-сосгоя-нием, промежуточным между N и D. Позже Гарел и Болдвин пришли к заключению, что двухстадийная кинетика денатурации рибонуклеазы вызвана наличием в равновесии двух взаимно превращающихся состояний несвернутого белка (Dj и D2), которые практически неразличимы для физико-химических методов [55, 56]. Относительное содержание D, и D2 не изменялось при варьировании концентрации гуанидингидрохло-рида и значений pH раствора, что указывало на их принадлежность к предельно развернутому состоянию белковой цепи. Процесс денатурации, по Гарелу и Болдвину, идет по формуле N D2 D] с быстрой стадией N D2 и медленной D2 Dj.
Что же собой могут представлять две полностью развернутые формы одного белка? Могут ли вообще отличаться флуктуирующие клубки одной и той же аминокислотной последовательности? Для положительного ответа на поставленные вопросы, по-видимому, существовал лишь один шанс и им воспользовались Брандте и соавт. [57]. Состояния Di и D2 могут отличаться, оставаясь при этом статистическими образованиями, конфигурационной топологией полипептидной цепи, связанной с возможностью пептидной группы принимать транс- и цис-форму. В состоянии D2, как и в N, все группы имеют транс-конфигурацию, а в состоянии D] определенная часть пептидных групп находится в цце-конфигурации. Наиболее вероятна конфигурационная изомеризация у групп, соединяющих остаток пролина с предшествующим остатком.
