Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
В первых кинетических исследованиях денатурации белков в 1968 г. Ф. Поул [47] и К. Тэнфорд [23, 48] не обнаружили промежуточных продуктов; кинетика процесса полностью отвечала переходу между двумя состояниями в соответствии с теорией Дж. Брандтса. Более сложное кинетическое поведение белков при денатурации удалось наблюдать в 1971 г. А. Икай и К. Тэнфорду при изучении скорости свертывания и развертывания полипептидных цепей лизоцима и цитохрома с с использованием техники стоп-флоу и УФ-спектроскопии [49]. Полученные зависимости интенсивности поглощения (у) от времени для двух белков приведены на рис. III.3. Кривые прямого и обратного процессов у лизоцима (рис. III.3,а) симметричны относительно урав„, и соответствуют приведенному выше уравнению реакции первого порядка. Кривые же цитохрома с (рис. III.3,6) не отвечают теории двух-
352
Рис. III.3. Кривые реакции денатурации и ренатурации лизоцима (а) и цитохрома с (б) в 2,5 М растворе гуанидингидрохлорида, 25°, pH 2,6 (а) и 6,5 (б)
По ординатам отложены коэффициенты экстинкции полос поглощения 301 нм (а) и 400 нм (б) для нативных (у^) и денатурированных (yD) состояний белков; параметр Уравн. отвечает условию равновесия D/N=l [49]
л
Урабн.
У»
фазного процесса и свидетельствуют о наличии в области перехода значительного количества помимо N и D еще одного состояния X. А. Икай и К. Тэнфорд приходят к нетривиальному заключению и вводят понятие о таком промежуточном состоянии, которое, являясь частично свернутой формой, в то же время не может трансформироваться непосредственно в N без предварительного развертывания. Иными словами, это состояние представляет собой "неправильно" свернутую конформацию белковой молекулы. Простейший механизм, отражающий такого рода взаимоотношения между состояниями белка в процессе его денатурации, может быть записан в виде N «1 D X. Согласно этой формуле первые шаги в свертывании полипептидной цепи, находящейся в состоянии статистического клубка, должны быть строго обратимыми и не влиять на конечный результат. Чем обусловлен такой непрямой путь свертывания белка в правильную нативную конформацию? По мнению авторов, он необходим in vitro, поскольку в этих условиях процесс может начаться на любом участке несвернутой полипептидной цепи, в то время как in vivo он начинается со свертывания N-концевой части (в предположении, что укладка белковой цепи в нативную конформацию происходит у N-конца еще до окончания синтеза).
Теперь можно сопоставить результаты термодинамического и кинетического исследования денатурации лизоцима и цитохрома с. П.Л. Привалов и Н.Н. Хечинашвили не выявили различия в механизме свертывания и развертывания этих белков [39]. Наблюдая хорошее совпадение вант-гоффовской энтальпии и тепловых эффектов, авторы сделали заключение об одинаковом механизме денатурации лизоцима и цитохрома с и соответствии механизма модели двух состояний. Кинетическое исследование денатурации этих же белков Икай и Тэнфордом с использованием гуанидингидрохлорида, независимо от отношения к трактовке авторов полученных данных, не дает оснований для такого вывода. Расхождение в термодинамической и кинетической оценках механизма денатурации цитохрома с тем более существенно, что, как было показано позднее Т. Тсонгом, этот белок даже в концентрированном растворе гуанидингидрохлорида не полностью денатурирован,
12. Проблема белка, т. 2
353
в то время как под действием температуры его денатурация идет до конца [50].
Тщательное параллельное изучение кинетических аспектов конформационных изменений и ферментативной активности при денатурации шести белков (фумаразы, энолазы, альдолазы, глицеральфос-фатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы и малатдегидрогеназы) было предпринято в 1971 г. Дж. Тейпелем и Д. Кошландом [51]. Для каждого объекта исследовано влияние на кинетику свертывания фермента и восстановление его биологической функции наличия в растворе соответствующего субстрата или кофактора (S), изменения ионной силы молекулы и концентрации. Заключения о конформационных изменениях делались по данным кривых дисперсии оптического вращения ферментов, показывающих характерный для них отрицательный эффект Коттона при 232—234 нм, и спектров флуоресценции в области 300— 400 нм.
Принципиальная схема повторного свертывания денатурированных белков in vitro, к которой Тейпель и Кошланд пришли на основе собственных экспериментальных данных и анализа имеющегося в литературе материала, отвечает следующей формуле:
X,
Эта формула сложнее формулы процесса денатурации цитохрома с по Икай и Тэнфорду [49]. Однако принципиальных противоречий между ними нет. Обе они не согласуются с теорией Брандтса, рассматривающей два состояния.
Относительно быстрая реставрация структуры ферментов по сравнению с медленным восстановлением их биологической активности показывает, что промежуточные конформационные состояния образуются в заметных концентрациях. Тот факт, что полученные на разных стадиях ренатурации спектры ДОВ и спектры флуоресценции не имеют изосбестической точки, совпадающей с пересечением спектральных кривых состояний N и D, свидетельствует о том, что все промежуточные состояния одновременно присутствуют в растворе и находятся в равновесии. Условия окружения, а именно: наличие или отсутствие специфических субстратов или кофакторов, их концентрация, значения pH раствора, ионной силы и концентрация белка, существенно влияют на скорость пространственной организации молекулы и на ее биологическую активность. Анализ полученных данных привел авторов к выводу, что свертывание фумаразы, энолазы и альдолазы определяется прежде всего термодинамическими факторами, а у трех других белков существенно влияние также кинетических факторов. У предста-
