Биоэлектрогенез у высших растений - Опритов В.А.
ISBN 5-02-004108-4
Скачать (прямая ссылка):
БИОЭЛЕКТРОГЕНЕЗ КЛЕТОК ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ В ПОКОЕ
1. МЕТОДИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ИЗМЕРЕНИЯ
ПОТЕНЦИАЛОВ ПОКОЯ КЛЕТОК ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ
Биоэлектрическая активность клеток высших растений в покое может быть измерена,как и у животных объектов, различными методами. Это прежде всего внутриклеточное или внеклеточное отведение биоэлектрической активности и метод флуоресцентных зондов. Учитывая то обстоятельство, что общие принципы указанных методов достаточно подробно изложены в различного рода пособиях, в настоящей главе мы считаем целесообразным обратить основное внимание лишь на те особенности, которые имеет измерение потенциала покоя 1?т клеток у высших растений.
Измерение потенциалов покоя в помощью электродов
Внутриклеточное измерение. Измерение Егт клеток высших растений посредством микроэлектродной техники, несмотря на большой прогресс, достигнутый в ее совершенствовании, до сих пор представляет собой весьма непростую задачу. Дело в том, что клетки высших растений наряду с жесткой клеточной стенкой и высоким ту-ргорным давлением, характерным и для клеток, например харовых водорослей, имеют, в отличие от последних, очень небольшие размеры. В этой связи удачное введение микроэлектрода в клетку высшего растения, позволяющее осуществить достаточно длительный эксперимент (в течение часа и более), требует от исследователя значительного навыка работы с такими клетками.
Микроэлектроды, используемые для измерения Ег„ клеток высших
растений, изготавливают обычно из стекла "Пирекс". Диаметр их кончика, с учетом малых размеров клеток объекта, не должен превышать 1 мкм. Микроэлектроды с диаметром кончика более 1 мкм при введении, как правило, сильно повреждают клетки высших растений.
Введение микроэлектродов осуществляют с помощью микроманипулятора под углом 30 — 60* к плоскости объекта (речь идет чаще всего о поверхности среза) и при визуальном контроле через микроскоп с большим увеличением (х 200 и более). Горизонтальное и вертикальное введение микроэлектродов, осуществляемое обычно "вслепую*. используется гораздо реже. Число повторных введений одного и того же микроэлектрода, учитывая большую вероятность притупления или слома его кончика о жесткую клеточную стенку, должно быть минимальным.
6
Для предотвращения попадания содержимого обладающих тургором клеток в канал введенного микроэлектрода последний заполняют гелем. С этой целью электролит (например. 3 М КС1), предназначенный для заполнения электрода, может быть приготовлен на 2Х-ном агаре [514].
Измерение?^, клеток высших растений производят по отношению к
водной среде определенного солевого состава, окружающей клетки объекта, укрепленного в экспериментальной кювете. В этой связи некоторые авторы [8], работающие с наземными высшими растениями, отмечают, что водная среда не является естественным условием обитания, например, для клеток поверхностных тканей листьев таких растений, и стремятся использовать методические приемы, позволяющие свести к минимуму число контактирующих клеток объекта с внешней водной средой. Однако измеряемые при этом Е?т и их реакция
в ответ на действие различных химических агентов, судя по всему, ничем не отличаются от таковых в экспериментах с традиционной методикой.
Регистрацию измеряемых Егт клеток высших растений осуществляют обычно на ленте самопишущего потенциометра через посредство усилителя. При этом для получения точности измерения выше IX входное сопротивление усилителя должно превышать сопротивление микроэлектрода более чем в 100 раз [146].
Величина измеряемых Егт в большой мере зависит от степени
шунтирования микроэлектродом таких клеточных мембран, как плаз-малемма и тонопласт (см. раздел 2). Следует также учитывать, что вокруг кончика микроэлектрода, локализованного в цитоплазме, последняя со временем способна формировать своего рода нчехол,<1 который вызывает резкое изменение измеряемого потенциала [112]. К резким колебаниям величины измеряемого Егт и как следствие вынужденному прекращению регистрации могут приводить и весьма незначительные изменения положения объекта в пределах экспериментальной кюветы в условиях длительного опыта, наступающие, например, в результате действия света (фототропизм). Это свидетельствует о том, что объект должен быть достаточно жестко фиксирован в экспериментальной кювете.
Следует отметить, что, помимо Егт. с помощью микроэлектродной техники могут быть также исследованы такие электрические характеристики мембран клеток высших растений, как омическое сопротивление, вольт-амперная характеристика и др. [253,380,381,405]. Методом пэтч-клямп. получившим большое распространение в последние годы, в опытах на изолированных протопластах и вакуолях клеток высших растений при использовании микроэлектродов в качестве микроприсосок осуществляется анализ проводимости одиночных ионных каналов [421,613,655]. Подробную информацию о методических
7
особенностях измерения перечисленных электрических характеристик можно найти в работах, на которые выше сделаны ссылки.
Внеклеточное измерение. Принцип внеклеточной регистрации биоэлектрической активности клеток высшего растения в покое основан на симпластической природе электрической полярности данного объекта [88,284]. При этом разность потенциалов A(/i,z между двумя точками поверхности, например стебля растения, может быть описана уравнением
