Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
Экспериментальные системы, обеспечивающие получение популяции
дифференциально маркированных клеток, представлены пятью обширными
группами:
1) экспериментальные химеры;
2) Х-инактивационные мозаики;
3) индивидуальные клетки, маркированные инъекцией специфического
соединения;
4) клеточные популяции, маркированные за счет интеграции клонированных
генов в некоторых клетках ранних эмбрионов;
5) маркеры, индуцированные мутацией соматической клетки.
Рассмотрим каждую из них.
Методы маркирования клеток и их применение
155
2. Химеры
2.1. Определение понятия "химера"
Химера - животное, в состав которого входят клетки, происходящие более
чем от одной зиготы. Обзор химер млекопитающих дан в работах [6, 7].
Различные клеточные популяции могут быть объединены в одном организме на
любой стадии жизни животного. Химеры, известные биологам развития, обычно
создаются путем комбинации клеток двух или более предимплантационных
эмбрионов, но они могут быть получены и введением в постимплантационные
эмбрионы (см. гл. 3, разд. 7 и 8) или во взрослый организм клеток иного
генетического происхождения. Пациент с трансплантированной почкой -
химера. В иммунологии и радиобиологии широко используются "радиационные
химеры", созданные посредством разрушения красного костного мозга и
лимфоидной ткани животного-хозяина облучением с последующей пересадкой
костного мозга от генетически отличающегося донора. Независимо от того,
каким способом получены химеры, принципы использования клеточных маркеров
остаются общими. В этой статье мы сосредоточим свое внимание на химерах
мышиных эмбрионов и их применении в биологии развития.
2.2. Типы химер и их получение
2.2.1. Эмбриональные агрегационные химеры
Для получения химер этого типа 4-8-клеточные эмбрионы от мышей разных
линий агрегируют в условиях культуры, после чего химерный эмбрион
переносят в матку псевдобеременной "приемной матери", где он продолжает
развиваться до рождения. Процедура описана в табл. 6.1.
2.2.2. Химеры, полученные инъекцией в бластоцисту
Для получения химерных эмбрионов чаще пользуются инъекцией одной или
нескольких клеток в бластоцисту, чем агрегацией двух морул. (Методика
описана в работах [8, 9].) Этот способ хотя и более трудоемкий, но имеет
некоторые существенные преимущества. Он не требует удаления блестящей
оболочки, поэтому может быть применен к получению химер у животных, не
способных без нее развиваться, например у кролика. Поскольку весь
трофобласт представляет собой ткань хозяина, не возникает препятствия для
имплантации при некоторых межвидовых комбинациях, для которых обычно
отторжение чужеродного эмбриона. При использовании для формирования
156
Г лава 6
Таблица 6.1. Создание агрегациоиных химер1
1. Подготовьте получение в один и тот же день 4-клеточных эмбрионов от
мышей двух линий, которые будут использованы для создания химер.
Подготовьте псевдобеременную самку для трансплантации химерных эмбрионов
на следующее утро.
2. Приготовьте культуральные каплн среды М16+БСА (гл. 2, рдзд. 5.2)
под маслом в пластиковой чашке (Falcon). Выдержите в инкубаторе
с 5% С02 при 37°.
3. Приготовьте две стеклянные панели с лунками для промывания
эмбрионов, каждая с 1 мл М16+БСА под слоем масла (по одному
стеклу для
каждой линии). Поместите в инкубатор.
4. Забейте самку (3-й день беременности) одной линии смещением шейных
позвонков. Следуя прописи в гл. 2, разд. 2.2, получите 4-8-клеточные
эмбрионы. Промойте в среде М2+БСА (гл. 2, разд. 5.2).
5. Удалите блестящую оболочку, поместив эмбрионы в проназу (гл. 2. разд.
3.2). Когда оболочка станет тоньше и помутнеет (это произойдет между 6-й
и 15-й мин), перенесите эмбрионы обратно в М2+БСА. Осторожно пипетируйте,
чтобы удалить все фрагменты оболочки. Не обрабатывайте за один раз более
15 эмбрионов. (Раствор кислого Тироде - см. гл. 2, разд. 3.2 - действует
быстрее, ио его сложнее контролировать, и риск повредить эмбрионы
повышается. Судя по нашему опыту, после проназы агрегация идет лучше.)
6. Перенесите эмбрионы в свежую среду М2+БСА.
7. Промойте эмбрионы в одном стекле для промывания средой М16+БСА (другое
используйте для второй линии).
8. Поместите по одному эмбриону в каждую культуральную каплю М16- +БСА~ в
чашке (Falcon) н поставьте в инкубатор. (Чтобы избежать изменения pH,
старайтесь не держать М16+БСА, даже под маслом, слишком долго вне
инкубатора).
9. То же проделайте с мышью другой линии. Поместите по одному эмбриону в
те же самые культуральные каплн, где уже находятся эмбрионы первой линии.
10. Подтолкните пары эмбрионов друг к другу концом вытянутой пипетки.
Повторите это в течение дня 2-3 раза.
11. Инкубируйте всю ночь.
12. На следующий день проверьте, сколько эмбрионов соединилось. Агрегаты
перенесите в псевдобеременную мышь-реципиент, как описано в гл. 13, разд.
6.4.
') Все детали, касающиеся извлечения эмбрионов, удаления блестящей
оболочки, среды культивирования, подготовки псевдобеременных приемных
