Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
6) или в очень холодном (-20 °С) ацетоне.
6. Последовательность инкубаций определяется опытным путем. Мы получаем
значительно лучшие результаты в том случае, когда конъюгат щелочной
фосфатазы добавляется перед пероксидазным конъюгатом, чем при их
одновременном добавлении или внесении в обратной последовательности.
Окрашивающая реакция пероксидазы должна предшествовать реакции щелочной
фосфатазы.
7. Выбор субстратов для контрастирующего двойного окрашивания. Несмотря
на наличие многочисленных субстратов, дающих различные цвета для щелочной
фосфатазы и пероксидазы, мы остановились на том, что наибольшую
интенсивность н надежность обеспечивают Brentamine Fast Red TR (для
щелочной фосфатазы) и диаминобензидин (ДАВ) (для пероксидазы, коричневый
цвет). Сочетание красного и коричневого представляется не самым удачным.
Многие пытаются усилить контраст добавлением солей тяжелых металлов к
раствору субстрата при пероксидазном окрашивании: например, добавление
50 мкл 8%-ного №С12 на 10 мл субстрата дает темно-пурпурный продукт
пероксидазной реакции, {i-галактозидаза (бирюзово-голубой продукт) дает
хороший цветной контраст в сочетании с красным окрашиванием щелочной
фосфатазой [32], но у нас его интенсивность оказалась все же меньше, чем
коричневый цвет, даваемый пероксидазой/ДАБ.
8. Контроль. Необходимым условием надежности анализа является присутствие
на каждом стекле рядом со срезами химерной ткани срезов соответствующей
ткани линий, составляющих химеру. Это обеспечивает положительный контроль
окрашивания и контроль специфичности. Кроме того, необходимо иметь по
крайней мере два стекла, каждое из которых инкубировано только с одним
или только с другим конъюгатом антитела, но окрашено обоими растворами
субстрата. С их помощью осуществляется контроль на неспецифическое
окрашивание и влияние одного конъюгата антитела на связывание другого.
Такой контроль особенно полезен, если вдруг возникает проблема
неспецифичности окрашивания в связи с тем, что один из конъюгатов
деградировал. Наконец, для контроля качества процесса окраски всегда
включайте стекло со срезами тимуса от каждой линии, содержащейся в
химере.
Метод двойного окрашивания Н-2Ь- и Н-2к-антигенов на срезах химерных
тканей СВА-*->С57 BL/6 описан в табл. 65 и про-
166
Глава 6
Вода, буфер и т. п.
Рис. 6.1. Лоток для иммуногистохимического окрашивания.
иллюстрирован рис. 6.2,Л. Процедуры, с помощью которых можно устранить
помехи, представлены в табл. 6.6.
3.2. Другие антигены
1. Антигены 1а могут быть выявлены при помощи моноклональных антител тем
же способом, что и Н-2-антигены. Они экспрессируются в костном мозге и
лимфоидных тканях, эндотелии и некоторых видах эпителия. Для каждого
антитела должен быть определен способ обработки ткани и условия фиксации.
2. Антигены Thy-1 также образуют полиморфическую систему, при этом AKR и
другие А-линии мышей экспрессируют аллель Thy-1.1, а другие
(преобладающее большинство)- Thy-1,2. К соответствующим антигенам можно
приобрести специфические моноклональные антитела. Есть сведения о том,
что Thy-1-антигены экспрессируются у мыши на поверхности Т-клеток, клеток
центральной нервной системы, на фибробластах и, возможно, на миоэпители-
альных клетках; другие виды по этому признаку отличаются. Паттерн
окрашивания, демонстрируемый иммуноги-стохимическим способом, в большой
степени зависит от использованного фиксатора, особенно в случае мозга.
Рис. 6.2. Визуальные маркёры хнмерности. А. Криостатный срез эпителия
толстой кишки химеры ВЮа-^-BlOScSncc. Крипты В10а (А) окрашены конъюгатом
анти-Н2к щелочной фосфатазы в красный цвет, на отпечатке оии выглядят
темными. Крипты BlOScSncc (В), окрашены конъюгатом пероксида-зьг с анти-
Н2ь в желто-коричиевый цвет и кажутся светлыми. Б. Обработанные ДВА
парафиновые срезы толщиной 4 мкм эпителия тонкой кишки химеры DDK-'-*-
C57BLl6J(B6), окрашенные АДБ-пероксидазным конъюгатом. На поперечном
срезе ворсинок виден центральный кор (G), окруженный эпителием (Е). В
эпителии выявляются полосы клеток, происходящих от В6 (они кажутся
черными), н клетки, происходящие от DDK (онн не окрашены). Коры ворсинок
содержат некоторое количество эндотелиальных клеток типа DDK, также
связывающих АДБ-пероксидазу. отчего они кажутся черными.
168
Глава 6
Таблица 6.6. "Помехи" при окрашивании Н-2-антигена и их устранение
1. Окрашивание слабое нли отсутствует.
Одно стекло/партня стекол.
Ошибка в процедуре разведении/добавления конъюгата на стекло. Только одно
антитело:
а) конъюгат антитела деградировал (это бывает довольно часто). Проверьте
на срезах тимуса;
б) субстрат не тот/деграднровал. Проверьте эндогенное окрашивание на
"неблокироваиных" стеклах, обменяйтесь реактивами с коллегами или
попробуйте другую надежную систему антител, если она доступна;
в) вариации между линиями мышей. У некоторых экспрессия Н-2-антнгена
происходит не одинаково в разных тканях. Проверьте иа срезах тимуса,
