Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
могут быть использованы с 1 мМ левамязола (Sigma) в качестве ингибитора
эндогенной щелочной фосфатазы во всех тканях, кроме кишечника ([33], см.
табл. 6.5, п. 18).
2. Одинаковые ферменты из различных источников, по-видпмому, отличаются
своей "липкостью", создавая проблему фона на гистологических препаратах.
Если возникнут подобные затруднения, стоит попробовать фермент из другого
источника.
3. Убедитесь в том, что все буферы (Tris) со свободными аминогруппами
удалены диализом из препаратов ферментов и антител.
4. Может возникнуть необходимость испытать ряд пропорций антитело :
фермент, чтобы выбрать наилучшую.
5. Тестируйте свежеприготовленный конъюгат в разведениях, возрастающих на
2^3 порядка, выберите дозу с наибольшей активностью при чистом фоне на
препарате контрольной ткани. Если появится окрашенный фон. решению
проблемы может помочь фракцнонированне конъюгата путем гель-фильтрации
(Sephadex G-200 или Sephacryl), особенно в случае пе-роксидззных
конъюгатов.
6. Не замораживайте конъюгат. Разделите на аликвоты и храните при 4 °С в
буфере при pH 7,5-8,0 с БСА (5 мг/мл) н азидом натрия (0,1%).
ется с анти- днф). Эти системы описаны в руководствах по иммунологии. По
нашим данным, наиболее воспроизводимые результаты дает третий подход -
прямая конъюгация каждого моноклонального антитела с индикаторной
молекулой. В этой роли могут выступать фермент или флуорохром.
Конъюгированные моноклональные антитела используются в процедуре двойного
окрашивания, описанной в табл. 6.5.
4. Некоторые моноклональные конъюгаты антитела анти-Н-2 (со щелочной
фосфатазой, пероксидазой, флуорохромами) можно приобрести. Этот выход из
положения мы считаем наилучшим, несмотря на дороговизну препаратов. Если
конъюгаты антител недоступны или предполагается использовать большие их
количества, приходится рассчитывать на собственные силы. Стандартные
методики приводятся в руководствах по иммунологии и в работах [30] и
[31]. Следует иметь в виду, что для получения достаточного для работы
количества антител вам может понадобиться линия клеток гибридомы и
концентрированный культуральный супернатант или асцитная жидкость.
Некоторые сведения, касающиеся приготовления конъюгатов фермент -
моноклональное антитело, можно почерпнуть из табл. 6.4.
5. Тканевый препарат. Поскольку антигенные детерминанты, узнаваемые
различными моноклональными антителами анти-Н-2, будут отличаться
чувствительностью к разным фик-
Таблица 6.5. Двойное Н-2-антнген-окрашнвание гистологических срезов,! г>
Время одного окрашивания 5-6 ч.
1. Используйте криостатные срезы нефиксированной ткани толщиной 4 мкм на
покрытых желатиной стеклах.
2. Высушенные препараты храните при -20 °С, пока не понадобятся (до
нескольких недель).
3. Планируйте процедуру окрашивания. Пронумеруйте стекла (карандашом или
концами замороженного стекла), н для каждого из них составьте схему
конъюгатов антитела и окрашивания. Помните, что сбиться очень легко,
поэтому не делайте сразу слишком много препаратов (30 стекол, если
комбинация антнтела/красители ие слишком сложна, 15-20, если она
усложнена).
4. Для окрашивания поместите стекла на пластиковый лоток (рнс. 6.1).
Проконтролируйте прн помощи уровня горизонтальность его положения. Дайте
стеклам высохнуть прн комнатной температуре по крайней мере 20 мин.
5. Сполосните PBS. Для этого бернте стекла одно за другим н поливайте
слабой струей нз специальной пластиковой бутылки, стараясь, чтобы струя
не попала на срезы. Следите за тем, чтобы водоотталкивающие части срезов
были покрыты буфером (их можно осторожно смочить из пастеровской
пнпетки). Стекла, покрытые PBS, снова поместите в лоток.
6. Фиксируйте ПЛП (0,5%-ный параформальдегид - 0,15 М лнзнн-10 мМ
перйодат натрия) в течение 2 мин (это время имеет существенное значение)
при комнатной температуре. Для этого слейте со стекол PBS н налейте из
пастеровской пипетки ПЛП. Фиксатор должен быть свежеприготовленным: 1
часть 4%-ного формальдегида в дистиллированной воде, 3 части 0,2 М лизина
и кристаллы перйодата натрия до 10 мМ. Маточный раствор лизина и
параформальдегида можно хранить при 4°С. Кристаллы перйодата иатрня
растворяются за несколько минут.
7. Смойте фиксатор со стекол слабой струей PBS.
8. Блокируйте эндогенную пероксидазу. Мы используем 0,1%-ный фенил-
гидразин-HCl в PBS, он не вызывает образования пузырьков (как методы,
основанные на пероксидазе), которые могут разрушить замороженные срезы.
Слейте со стекол PBS и налейте феннлгндразин-HCl. Оставьте на 5 мин,
затем высушите стекла п промойте PBS, как делали раньше.
9. Промойте стекла PBS, содержащим 0,5%-ный бычий сывороточный альбумин
(PBS+БСА).
10. Если не предполагается использование конъюгата антимышиного Ig,
инкубируйте стекла в течение 15 мин прн комнатной температуре с PBS,
содержащим 10%-ную мышиную сыворотку (любой линии), для блокирования
неспецифических сайтов связывания мышиных иммуноглобулинов. Тем временем
