Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
Мы изложим подробно лишь методики использования Н-2-антигенов и
углеводного полиморфизма. Способы применения других маркеров и краткие к
ним комментарии представлены в табл. 6.2.
3.1. Использование в качестве маркера Н-2-антигенов
Н-2-,антигены могут быть обнаружены иммуноцитохимичсски при помощи
моноклональных анти-Н-2 антител во многих тканях мыши старше 7 дней [30]
(см. табл. 6.3).
160
Глава 6
Таблица 6.3. Иммуногистохимическая локализация Н-2-антигенов у мыши
Постоянно присутствует
Эпителий
Тонкая кишка
Толстая кншка Матка
Молочная железа Кожа
Трахея
Переходный эпнтелнй почечной лоханкн Собирающие почечные канальцы Протоки
слюнной железы
Околоушной ацннус
Другие ткани Мозговой слой тнмуса Селезенка
Лимфатические узлы Пейеровы бляшки Клетки моноцитарно-фа-гоцнтарного ряда
Эндотелий сосудов
Клетки выстнлкн печеночных лакун Паренхима легких1) Аднпоцнты
Присутствует иногда
Мочевой пузырь Бронхи
Железистый желудок Желчный проток Проток поджелудочной железы Половой
тракт (кроме маткн)
Фолликулы щитовидной железы Ацннус слюнной железы
Почечные клубочки Интерстициальные клетки семенника
Постоянно отсутствует
Слущнвающнйся эпителий Язык Глотка
Шейка маткн Влагалище
Гепатоциты
Надпочечники Клетки панкреатического островка Фолликул яйцевода Головной
н спинной мозг Периферический нерв
Скелетная мышца и мышца сердца
') Диффузное окрашивание стенок альвеол, не приуроченное к определенному
типу клеток.
Хотя экспрессия Н-2-антигена у мышиного эмбриона может -быть обнаружена
серологически, только в клетках тимуса на поздних этапах беременности
присутствует такое количество антигена, которое достаточно для проведения
иммуноцитохими-ческого анализа. Пока нет данных о том, что различия по Н-
2-антигену между линиями, составляющими химеру, оказывают влияние на ее
развитие, однако считать это доказанным нельзя.
Преимущества мечения Н-2-антигенами заключаются в большом выборе тканей и
линий мышей, а также в возможности окрашивания клеток двух генотипов на
одном и том же срезе (при использовании антител к различным Н-2-
антигенам).
Методы маркирования клеток и их применение
161
Основной недостаток этой методики - ее технические трудности. Во-первых,
многие эпитопы (антигенные детерминанты) оказались лабильными в отношении
фиксаторов и смол, используемых для заключения, вследствие чего можно
пользоваться только свежефиксированными криостатными срезами (см. ниже).
Во-вторых, Н-2 антигены экспрессируются на клеточной поверхности и
разрешение окрашивания на уровне одной клетки в смешанной ткани не всегда
удовлетворительное.
Ниже перечислен ряд условий, которые необходимо соблюдать при организации
эксперимента. Некоторые из них являются обязательными в любом
эксперименте, основанном на иммуноцитохимии с моноклональными антителами.
1. Выберите подходящие для вашего опыта антитела (источники:
коммерческий, American Type Culture collection, другие лаборатории) и
линии мышей. Гаплотипы мышей по Н-2-анти-гену описаны у Грина [10].
2. Проверьте специфичность антител выбранных линий на криостатных срезах
тимуса молодых взрослых мышей. Срезы от каждой линии, расположенные на
одном стекле, нефиксированные и фиксированные ПЛП (см. ниже, табл. 6.5),
инкубируют с серийными разведениями моноклонального антитела (используют
утраивающиеся разведения 1 : 10->-1 : 810). Моноклональное антитело может
быть помечено прямо (см. ниже) или обнаружено при помощи второго антитела
- антимышино-го иммуноглобулина, конъюгированного с пероксидазой или
щелочной фосфатазой. Если оптимальный титр второго антитела еще не
известен, его можно определить, воспользовавшись серией утраивающихся
разведений второго антитела с каждым разведением первого антитела.
Оптимальной следует считать ситуацию, когда мозговой слой тимуса одной
линии сильно окрашивается разведением его специфического моноклонального
анти-Н-2-антитела, не дающего окрашивания тимуса другой линии. Некоторое
слабое окрашивание может возникнуть благодаря второму (антимы-шиному)
иммуноглобулиновому антителу, - в таком случае необходим контроль без
анти-Н-2-антитела.
3. Если требуется, чтобы на одном и том же срезе химерной ткани
одновременно окрашивались клетки обоих фенотипов, необходимо выбрать
соответствующую стратегию. Этого можно добиться, используя моноклональные
антитела разных подклассов в качестве первых антител, а в качестве вторых
- антитела, специфические для подклассов IgG. С другой стороны, можно
использовать непрямой метод гаптенизированных антител (т. е. одно
моноклональное антитело связывается с биотином, затем со стрептавидином,
а другое моноклональное антитело, конъюгированное с динитрофенолом (ДНФ),
связыва-
11-171
162
Глава 6
Таблица 6.4. Приготовление конъюгатов фермента с антителом (советы
овладевающим методикой)
1. Для приготовления конъюгатов щелочной фосфатазы используйте фермент
высокой специфической активности (Boehringer нлн Sigma). Эти конъюгаты
