Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
VIII. ПРИМЕРЫ
В данном разделе описываются обычные приемы проведения цитофлуориметрических измерений и обсуждаются возникающие при этом проблемы.
А. Титрование реагента
Для каждого реагента, используемого в проточной цитометрии, необходимо подбирать оптимальную концентрацию. Это можно сделать, обрабатывая клетки, заведомо способные окрашиваться данным реагентом, растворами реагента разной концентрации (рис. 20-8). При высоких концентрациях реагента часто наблюдаются эффекты неспецифического окрашивания. На рис. 20-8, А левый крайний пик существенно сдвинут по отношению к положению того же пика на рис. 20-8, Б—Г. Правильная концентрация реагента — это наименьшая концентрация, при которой пик позитивных клеток имеет максимальную или близкую к ней интенсивность окрашивания (рис. 20-8,Б в данном примере).
Б. «Слабопозитивные» образцы
На рис. 20-9 показаны результаты, которые можно объяснить одной из двух причин. Пик опытной пробы незначительно сдвинут по отношению к пику, соответствующему негативному контролю. Не исключено, что «наблюдаемое» окрашивание является артефактом, т. е. слабое позитивное окрашивание опытной пробы регистрируется из-за того, что негативный контроль не дает адекватного уровня неспецифического окрашивания. Если же удается убедиться в специфичности наблюдаемой реакции, то следует заключить, что плотность антигенных детерминант на клетках исследуемой пробы низка по отношению к фону. В том случае, когда экспериментальное распределение
23—1278
354 Глава 20
1 10
Интенсивность флуоресценции
100 1000
Рис. 20-8. Титрование реагента.
имеет один пик и в значительной мере перекрывается с негативным контролем, попытки достоверно определить долю специфически окрашенных клеток обречены на провал.
В. Высокий уровень фона
Высокий уровень фонового окрашивания при цитофлуори-метрическом анализе затрудняет выявление антигенов, присутствующих в низких концентрациях, и (или) малочисленных субпопуляций клеток. При этом чаще всего встречаются две ситуации: 1) уровень фонового окрашивания равномерно высок, т. е. соответствующий пик фона имеет унимодальный характер, и 2) высокий уровень фона характеризуется неоднородным распределением. Для оценки уровня фонового свечения необходимо сравнить его с флуоресценцией неокрашенных жизнеспособных клеток. При определенном цвете флуоресценции минимальным достижимым уровнем фона является интенсивность аутофлуоресценции клеток. Чаще всего высокий фон объясняется:
Методы сортировки клеток в иммунологии
355
0,01-
о
2
о и о га
1000
Интенсивность флуоресценции (условные единицы)
Рис. 20-9. Результаты получаемые при очень низкой интенсивности окрашивания. Спленоциты мыши были обработаны моноклональными антителами (черные точки) или их для контроля оставляли необработанными (светлые кружки). Затем их инкубировали с меченным ФИТЦ реагентом, специфически связывающимся с моноклональными антителами.
1) недостаточной чистотой реагентов, 2) слишком большим содержанием метки в реагентах и 3) присутствием в пробе мертвых клеток, не исключенных из анализа. Если распределение фонового свечения носит унимодальный характер, как показано на рис. 20-10, Л, то основным следствием этого будет снижение чувствительности анализа. В этих ус-
1 10 100 1000 1 10 100 1000
Интенсивность флуоресценции
Рис. 20-10. Два примера высокого уровня фона. На обоих рисунках (А и Б) негативный контроль (черные точки) сопоставляется с соответствующей пробой, ие подвергавшейся окрашиванию (светлые кружки). Пробы негативных 'контролен были обработаны только мечеными антителами. В идеальном случае вторые антитела не должны взаимодействовать с клетками.
23*
356 Глава 20
Окрашенный препарат Негативный контроль
?1 о zf
О I
X CD СО =Г S О и ? X ? CD О »- > х с;
Агглютинированные
клетки
Интенсивность светорассеяния
Рис. 20-11. Выявление эффекта агглютинации, вызванного избыточной концентрацией моноклональных антител.
" 0,005- Агглютинация - Нет агглютинации
О
*-
у S
го |-
с О
го 2 К-
х cj
^ 3-
*- CL •к* "
CJ о ¦ й ’Г. v :• '«
X -W- %
б У .v.
1 10 100 1000 1 10 100 1000
Интенсивность флуоресценции
Рис. 20-12. Искажение результатов, вызываемое агглютинацией.
