Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
си
CL ;
У-
о
со __: \ . , _v >>
500 1000 500 1000
Номер канала
500 ' 1000 1 Ю 100 1000
Интенсивность флуоресценции (условные единицы)
Рис. 20-6. Результаты экспериментов по окрашиванию ДНК, получаемые при линейном (Л) и логарифмическом [Б) режимах усиления.
возможность следить за отсчетами для всех клеток в пределах одной шкалы. Кроме того, в большинстве случаев измерения флуоресцентного окрашивания клеточных поверхностей (и аутофлуоресценции) наблюдается асимметричное распределение. Применение логарифмического усилителя позволяет получать более симметричные распределения, что помогает отличать одну субпопуляцию клеток от другой.
Сравнение данных, полученных с помощью линейного и логарифмического усилителей, представлено на рис. 20-5. Лимфоциты из периферической крови овцы были окрашены непрямым методом с помощью моноклональных мышиных антител и меченной ФИТЦ антисыворотки к иммуноглобулинам мыши. В режиме логарифмического усиления сразу видно, что моноклональные антитела выявляют три субпопуляции лимфоцитов. Интенсивность флуоресценции изменяется в диапазоне трех порядков. На этом же рисунке (рис. 20-5,?—Г) представлены три картины для той же пробы, но полученные при линейном усилении с различными коэффициентами усиления. Ни в одном из
Методы сортировки клеток в иммунологии
347
этих трех случаев не удается различить три пика, соответствующих трем субпопуляциям, выявляемым с помощью логарифмического усилителя.
VII. АНАЛИЗ ДАННЫХ ПО ОДНОМУ ПАРАМЕТРУ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Основной формой анализа результатов проточной цитометрии является обработка данных по одному параметру. Иногда экспериментатор заинтересован в одновременном анализе нескольких параметров, но обычно ему приходится проводить обработку данных только по одному из них. При таком анализе окрашенной и контрольной проб возникает ряд вопросов. 1) Какую долю клеток в популяции можно считать окрашенной по сравнению с уровнем фона? 2) Сколько субпопуляций клеток четко выявляется в пробе? 3) Какую долю общего числа клеток составляет каждая субпопуляция? 4) Какова интенсивность сигнала по регистрируемому параметру для каждой субпопуляции?
Со статистической точки зрения цитофлуориметрический анализ представляет собой исследование выборки (скажем, 50 000 клеток) из популяции клеток (например, спленоцитов) с регистрацией одного или нескольких параметров данной выборки. Информация, которую получают после эксперимента, включает данные о частоте встречаемости клеточных субпопуляций, различающихся по измеряемому параметру (или параметрам). Мы обычно строим распределение частоты встречаемости (то, что статистики назвали бы «функцией плотности»), в котором для каждого уровня интенсивности откладывается число клеток в пробе с данной флуоресценцией. Это распределение строят, откладывая по оси х интенсивность флуоресценции, а по оси у частоту встречаемости этого значения, чтобы определить, существуют ли четкие пики субпопуляций, выделенных по данному параметру. На рис. 20-7 светлые кружки соответствуют клеткам негативного контроля, а черные точки—-клеткам пробы, окрашенным с помощью моноклональных антител. Клетки, обработанные моноклональными антителами, ноне связавшие их, дают пик в том же месте, что и клетки негативного контроля. Клетки, с которыми связалось значительное количество антител, дают пик, располагающийся справа от пика негативного контроля.
А. Представление результатов
Первым этапом анализа по одному параметру является графическое представление результатов. Наиболее рационально откладывать возрастающие значения (номера канала) параметра
348 Глава 20
против относительной частоты его встречаемости. Откладывая по оси у относительную частоту встречаемости, а не реальное число соответствующих клеток, удается добиться того, чтобы шкала на этой оси не зависела от числа проанализированных клеток. Для расчета относительной частоты встречаемости данного уровня интенсивности флуоресценции (номера канала) число клеток, характеризуемых этим значением параметра, де-
Т I I г --------1--------1-------1--------г*
1 10 100 1000 1 10 100 1000 Интенсивность флуоресценции
Рис. 20-7. Два примера анализа данных, получаемых при окрашивании клеточных поверхностей.
лят на общее число проанализированных клеток. Такие распределения называют нормированными. В случае ненормированного распределения у двух проб с одинаковой картиной окрашивания распределения будут различаться, если для этих проб проанализировано разное число клеток.
На основании графического представления результатов, полученных для опытной и контрольной проб, можно сразу же сказать, есть ли в опытной пробе позитивно окрашенные клетки и сколько субпопуляций клеток позволяет выявить это окрашивание (рис. 20-7). Кроме того, достаточно легко определить долю клеток исходной пробы, содержащуюся в той или иной субпопуляции. В нормированном распределении площадь под кривой в интервале значений по оси х соответствует той части субпопуляции, которая приводится в таблице для соответствующих интервалов.
