Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
2. Если есть такая возможность, через сортировочную камеру пропускают поток стерильного воздуха. На приборе FACS-установлен насос, который откачивает из камеры аэрозоли и возможные контаминирующие вещества. Уже этого достаточно-для предохранения клеток от возможных загрязнений. Кроме того, многие цитометры оборудованы источником стерильного-воздуха, который создает поток, окружающий камеру (а иног-
22*
340 Глава 20
да рабочую поверхность). Хотя мы предпочитаем работать с подачей стерильного воздуха в камеру, так как опасность загрязнения в комнате невелика, необходимо отметить, что неоднократно удавалось проводить стерильный сортинг без поддув-ки стерильного воздуха и при этом не было выявлено никаких загрязнений.
3. Соблюдают все меры предосторожности, обычные при работе со стерильным материалом.
VI. ПОЛУЧЕНИЕ И НАКОПЛЕНИЕ ДАННЫХ
При исследовании того или иного образца на проточном цитометре следует заранее четко определить, какие параметры будут измеряться, как будут дискриминироваться данные и какое будет использовано усиление.
А. Установка окон дискриминации
Установка окон — это процесс, с помощью которого из всех регистрируемых событий выбирают те, которые интересуют экспериментатора (разд. II, Б). Например, типичная суспензия клеток селезенки мыши содержит не только живые лимфоциты, но и эритроциты, и мертвые лимфоциты. Устанавливая окна соответствующим образом, можно получать данные о флуоресценции только живых клеток и исключить эритроциты и мертвые клетки из анализа.
На рис. 20-2 показана картина, получаемая в режиме «dot plot». По оси х отложена интенсивность светорассеяния, а по оси у— интенсивность флуоресценции иодистого пропидия (ИП). ИП связывается с ДНК и дает флуоресценцию в красной области. Здесь ИП использован для выявления мертвых клеток, так как он окрашивает только клетки с разрушенной мембраной. Каждая точка на рисунке представляет данные, полученные по одной частице, прошедшей через пучок лазера. На левой картине выявляются три популяции частиц: I) эритроциты (и остатки ткани) соответствуют пятну слева внизу — они не окрашиваются ИП и слабо рассеивают свет; 2) мертвые клетки локализованы в верхней части картины — они окрашиваются ИП; 3) жизнеспособные лимфоциты соответствуют пятну, расположенному внизу правее эритроцитов; они не окрашиваются ИП и рассеивают свет интенсивней, чем эритроциты. Рис. 20-2 (слева) демонстрирует очень полезное для цитофлуориметрии свойство клеток большинства типов, состоящее в том, что чаще всего мертвые клетки менее интенсивно рассеивают свет (переднее рассеяние света, ПРС), чем живые. Данные, касающиеся живых лимфоцитов, можно накапливать, регистрируя только
Методы сортировки клеток в иммунологии
341
измерения для клеток, имеющих более высокую интенсивность ПРС, чем значение, указанное штриховой линией. Обратите внимание, что справа от этой линии находится очень мало клеток, окрашивающихся ИП. Этот критерий является примером установки дискриминационного окна. Если дискриминирующее значение рассеяния света взять слишком низким, то в флуоресценцию могут внести свой вклад мертвые клетки или эритроциты. Вместе с тем, если это значение будет завышено, мы можем исключить из анализа существенную долю небольших по размерам жизнеспособных клеток.
и с
си S CL CI О S >• С
с; о •& а.
Спленоциты мыши
Мертвые
клетки
Эритроциты Жизнеспособные
tew лимфоциты
ш ш :
Культивируемая пиния клеток
Интенсивность
Рис. 20-2. Пример установки окон дискриминации для накопления данных об интересующей популяции жизнеспособных клеток.
Использование ПРС для дискриминации живых и мертвых клеток дает хорошие результаты, когда клетки имеют высокую жизнеспособность и коэффициент вариации распределения клеток по размерам не слишком велик. Эти два условия в целом удовлетворяются, если клетки получают из свежих тканей, селезенки или лимфатических узлов. Если жизнеспособность популяции клеток падает до 80% или ниже, то при попытках дискриминации только по ПРС могут возникнуть трудности, в особенности для клеток, получаемых из костного мозга, и для большинства клеточных линий, культивируемых in vitro. Пример такой ситуации показан справа на рис. 20-2. Здесь в том же режиме, что и на рисунке слева, представлены данные для клеток культивируемой опухолевой линии (Х38) с жизнеспособностью примерно 40%. Обратите внимание на то, что мертвые клетки (положительные по связыванию с ИП) в целом расположены левее живых клеток. Тем Ке менее, опираясь только на ПРС, не удается исключить основную долю мертвых клеток, не затронув значительной части живых. В тех случаях, когда окрашивание ФИТЦ и ПРС при совместном использовании не дают возможности надежно дискриминировать живые и мертвые
342 Глава 20
клетки, лучше всего исключать мертвые клетки по данным ПРС и окрашивания ИП (как это показано на рисунке штриховыми линиями, образующими прямой угол). В противном случае могут возникнуть проблемы с высоким фоновым окрашиванием (разд. VIII,Г).
