Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
ловиях возможно определение частоты встречаемости любой субпопуляции клеток, у которых плотность антигена достаточна* для того чтобы интенсивность флуоресценции превысила уровень фона. Однако при этом можно не обнаружить субпопуляции с низким содержанием антигена. Несколько иная ситуация возникает в том случае, когда распределение фонового сигнала неоднородно (т. е. представлено несколькими пиками; рис. 20-10,Б). На рис. 20-10,5 пик, находящийся справа от основного, соответствует мертвым клеткам. В данном случае клетки с интенсивностью флуоресценции выше основного пика будут детектироваться, если они присутствуют в пробе в достаточных количествах. Если же число таких клеток в субпопуляции невелико, то они могут выпасть из подсчета.
Методы сортировки клеток в иммунологии
357
Г. Артефакты, обусловленные агглютинацией клеток
Некоторые реагенты вызывают при окрашивании образование небольших скоплений клеток, что может приводить к значительным искажениям получаемых результатов. Агглютинация чаще всего наблюдается при применении поливалентных реагентов, таких как, например, IgM-антитела и лектины. Агглютинацию легко идентифицировать в режиме «dot plot» (разд. VI, А) по полосе яркоокрашенных клеток, отмеченных на рис. 20-11,А. Агрегаты имеют более высокие уровни светорассеяния, чем одиночные клетки негативного контроля (рис. 20-11, Б). На рис. 20-12 представлены два распределения, демонстрирующие типичные артефакты, обусловленные агглютинацией. При высоких концентрациях антител наиболее «яркий» пик (крайний справа) невелик (по интенсивности) по сравнению с аналогичным пиком при более низких концентрациях антител. Это объясняется тем, что при высоких концентрациях антител образуется много агрегатов клеток. Сортер считает каждый агрегат как одну клетку и поэтому занижает число положительно окрашенных клеток. Кроме того, если агрегаты распадаются на отдельные клетки непосредственно перед прохождением через пучок лазера (как это часто происходит на самом деле), сортер автоматически исключает такие клетки из анализа, так как они идут слишком близко друг к другу.
БЛАГОДАРНОСТИ
Я благодарю д-ров К- Стейнберга и И. Лефковитса за критический анализ рукописи. Я признателен д-ру М. Миязаке, миссис Л. Дадлер и д-ру Дж. Бордману за предоставление данных для некоторых рисунков.
Рекомендуемая литература
Herzenberg L. A., Sweet R. G„ Herzenberg L. А. (1976). Sci. Amer, 234, 108.
Глава 21
Таблицы для оценки экспериментов с использованием метода лимитирующих разведений
Ч. Стейнберг, И. Лефковитс
I. ВВЕДЕНИЕ
Метод лимитирующих разведений может быть использован для определения частоты встречаемости иммунокомпетентных клеток, составляющих малую долю популяции, без их предварительной очистки. Методика лимитирующего (предельного) разведения была описана в сборнике Immunological Methods (19791), под редакцией Лефковитса и Перниса) и, кроме того, неоднократно обсуждалась в других изданиях (Lefkovits, Wald-man, 1979, 1984; Henry e!t al., 1980; Zauderer, 1984).
Для опытов с использованием метода лимитирующих разведений, в которых имеют дело с небольшим числом проб, существуют таблицы и кривые, которые облегчают планирование и оценку таких экспериментов (Lefkovits, 1979; Lefkovits, Waldman, 1979). Обычно в этих опытах в качестве культуральной посуды используют панели Терасаки, которые имеют 60 лунок объемом по 10 мкл, а также панели для микротитрования, которые имеют 96 лунок объемом по 0,2 мл. Представленные в данной главе таблицы пригодны как для опытов, в которых используется лгаиь часть лунок, так и для опытов, которые ставят на нескольких панелях.
Мы опишем три типа таблиц и кривых. К первому типу относится набор кривых, выражающих долю положительных культур и долю культур, содержащих чистые клоны, как функцию числа внесенных клеток предшественников (рис. 21-1). Ко второму типу относятся таблицы 95%-ных доверительных интервалов (табл. 21-1а — 21-1з) частоты встречаемости клеток, основанные на числе культур, не давших роста. К третьему типу относятся таблицы (табл. 21-2а — 21-2л) оценки независимости двух параметров, измеренных для одного и того же набора культур.
1> Опубликован русский перевод этой книги: Методы исследований в иммунологии.— М.: Мир, 1981. — Прим. ред.
Таблицы для оценки экспериментов
359
Среднее число клонов на культуру 0 1 2 3 4 5 6 7
Рис. 21-1. Процент клонов как функция среднего числа клеток-предшественни-ков на лунку. / — доля лунок, ие содержащих отвечающих клеток; 11—доля лунок, содержащих клон, возникший из одной клетки-предшественника; 111 — доля луиок, содержащих клоа, возникший более чем из одной клетки-предшественника; IV — доля культур, содержащих клон, возникший из одной клетки-предшественника, по отношению ко всем культурам, содержащим клоны.
II. ПРОЦЕНТНОЕ СОДЕРЖАНИЕ КЛОНОВ,
ПРОИСХОДЯЩИХ ИЗ ОДНОЙ КЛЕТКИ
Независимо от того, как мало клеток в расчете на одну лунку используется в опытах по лимитирующему разведению, в некоторой доле лунок вырастают колонии, происходящие более
