Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Лефковитса И. -> "Иммунологические методы исследований" -> 137

Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.

Лефковитса И., Перниса Б. Иммунологические методы исследований — М.: Мир, 1988. — 530 c.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка): immunologicheskiemetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 131 132 133 134 135 136 < 137 > 138 139 140 141 142 143 .. 239 >> Следующая

Опытная проба 1---250 135(3,5) 138(3,6) 148(3,9)
251---600 431(53) 436(55) 442(59)
601---1024 703(649) 704(654) 698(619)
Контрольная проба 1---1024 113(2,8) 114(2,8) 174(5.0)
*) Значения, приведенные без скобок, даны в единицах номеров каналов. Поскольку данные были получены в режиме логарифмического усиления, номера каналов не отвечают непосредственно интенсивности флуоресценции. Значения в скобках, которые были рассчитаны по приведенной в тексте формуле, даны в условных единицах интенсивности флуоресценции. Из-за логарифмического усиления даииые в скобках в столбце «среднее» являются среднегеометрическими величинами.
ления и наличие значений, которые или слишком высоки, или слишком низки для измерений. Медиана чувствительна к подобным влияниям в чрезвычайно редких случаях, поскольку она не зависит от других параметров распределения (непараметрическая статистика). Также редко подвержена этим влияниям и мода.
В качестве примера в табл. 20-2 приведены среднеарифметическое, медиана и мода для каждой из субпопуляций, представленных на рис. 20-7. Для сравнения те же статистические данные приведены для негативного контроля. Единицы, в которых представлены все величины, — это «номера каналов». Поскольку приведенные результаты были получены при логарифмическом усилении, соответствующие статистические данные об интенсивности флуоресценции представлены в условных единицах. Это сделано для того, чтобы было понятно, что означают те или иные номера каналов. Так как был использован четырехразрядный режим логарифмического усиления, на порядок приходится 250 каналов. Это означает, что разнице в 250 каналов соответствует отношение интенсивности 10. Для перевода номера канала в интенсивность флуоресценции использовали следующую формулу:
Условные единицы флуоресценции= 10№омеРа каналов/250)-1]_
Условные единицы интенсивности флуоресценции приведены в таблице в скобках. При использовании логарифмического усиления средние параметры флуоресценции соответствуют среднегеометрическому, а не среднеарифметическому.
¦352 Глава 20
В. Контроли
Негативный контроль должен характеризовать уровень флуоресценции исследуемой пробы в отсутствие специфического взаимодействия реагента с клетками. Такая неспецифическая флуоресценция может возникать как из-за «аутофлуоресценции», т. е. флуоресценции самих компонентов клетки, так и вследствие неспецифического связывания реагента. Идеальной контрольной пробой является проба, обработанная таким же ¦ способом, как и в опыте, но с использованием реагента, которому каким-то образом придана «негативная» специфичность. При применении метода прямого окрашивания хорошим контролем является проба, в которой клетки обрабатывали реагентом, приготовленным на основе антител того же изотипа и содержащим то же количество конъюгированного флуорохрома, что и реагент, используемый в опыте, но обладающим другой специфичностью. Для контроля специфичности окрашивания исследуемых клеток реагентом против одного аллеля маркерного антигена можно обработать этим же реагентом клеточную популяцию мыши, конгенную по другому аллелю этого же антигенного маркера (если такая конгенная линия существует). При использовании непрямого метода к постановке идеальных контро-.лей предъявляются такие же требования плюс дополнительный контроль второго (меченного флуорохромом) реагента.
На практике при выполнении цитофлуориметрического анализа ставить для каждого из используемых реагентов все необходимые контроли затруднительно. Часто возникающие сомнения разрешаются в результате тщательной проверки специфичности соответствующего рабочего реагента. В случае моноклональных антител можно ограничиться проверкой чистоты препарата антител. При использовании гетерологичных антисывороток следует убедиться в том, что они не реагируют с клетками (или клеточными линиями) других типов, которые не содержат соответствующих лигандов (антигенов). После того как продемонстрирована высокая специфичность реагента, можно использовать достаточно простые контроли. В прямом методе адекватным негативным контролем могут служить неокрашенные клетки. Эквивалентным такому контролю вариантом в непрямом методе является обработка клеток только вторым (меченным флуорохромом) реагентом.
Если в пробе присутствует слишком много мертвых клеток, то при некоторых условиях (при использовании для дискриминации мертвых и живых клеток только светорассеяния) значительное число мертвых клеток может быть зарегистрировано как живые. Мертвые клетки неспецифически захватывают метку, что при прямом методе окрашивания может проявиться
Методы сортировки клеток в иммунологии
353
в виде ложноположительных отсчетов, в то время как в неокрашенном контроле эти клетки выявляются в негативном пике. При использовании непрямого метода мертвые клетки в негативном контроле будут подсчитаны как позитивные по окрашиванию, поскольку контрольная популяция подвергалась обработке меченым реагентом. Имеется два способа избежать затруднений. Необходимо или работать с пробами, содержащими достаточно жизнеспособные клетки, или использовать окрашивание иодистым пропидием (ИП) для исключения из подсчетов (благодаря установке окна регистрации) мертвых клеток (разд. VI,А и IV,Б).
Предыдущая << 1 .. 131 132 133 134 135 136 < 137 > 138 139 140 141 142 143 .. 239 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed