Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.
Скачать (прямая ссылка):
На всех этих микротомах ножи неподвижно закреплены, а объект, опускаясь вниз, режется иа тонкие срезы только в момент соприкосновения его с режущей кромкой ножа (рис. 32). При обратном движении объекта вверх из-за того, что после изготовления одиночного среза зазор между ножом и образцом очень мал, возможен «обратный захват» среза. Чтобы избежать захвата срезов при обратном движении образца, в ряде микротомов осуществлено движение образца по кругу (микротом Шестранда, УМТ-2) нли по параллелограмму (микротом
Портера — Блюма, Хаксли). В ряде ультрамикротомов расхождение ножа и образца при его обратном ходе осуществляется за счет магнитострикционного сжатия стержня, несущего образец (ультрамикротом Хаанстра [80], УМД-5), или за счет отвода держателя ножа назад при помощи электромагнита (Ультра-том-4800) .
Все типы ультрамикротомов очень чувствительны к механическим сотрясениям и к колебаниям температуры. Оба фактора могут влиять на качество изготовления ультратонких срезов.
Ультратонкие срезы, если их собирать на поверхности самого ножа, сминаются, ломаются и прилипают к стеклу. Чтобы избежать этого, на верхнюю часть ножа помещают ванночку или корытце, заполненное жидкостью, на поверхность которой и попадают изготовленные срезы. Отсюда их легко выловить и перенести на специальные сетки (см. выше).
В ряде случаев, когда собственной «окраски» клеточных структур четырехокисью осмия недостаточно, можно проводить дополнительное контрастирование срезов при помощи водных растворов солей тяжелых металлов. Некоторые из таких солей откладываются на любых клеточных структурах, в то время как другие соли взаимодействуют лишь с оправленными клеточными компонентами. Так, уранилацетат контрастирует все структуры, но более быстро и прочно связывается с гранулами рибонуклеопротеидов и с волокнами соединительной ткани [81]. Хорошо контрастирует мембранные структуры клетки фосфор-номолибденовая кислота, но особенно четко она окрашивает гликоген [81]. Широкое распространение при контрастировании получили соли свинца (ацетат свинца, гидроокись и моноокись свинца) [82]. Они хорошо контрастируют любые структуры, особенно мембранные. Контрастирование можно проводить не только на срезах, но и на кусочках тканей до их помещения в пластмассы.
г. Специальные приемы обработки тканей и срезов
Метод исследования ультратонких срезов в электронном микроскопе можно успешно сочетать с рядом специальных методов, таких, как, например, гистохимия, радиоаутография, иммунохимия.
Применяя гистохимические реакции при исследовании тканей в электронном микроскопе, необходимо соблюдать следующие требования. Конечные продукты реакции должны откладываться в местах локализации того или иного химического компонента клетки и не менять своего положения при дальнейшей обработке объекта. Качество и количество конечного продукта должны давать возможность определять места его локализации в клетках или тканях,
Кроме этих двух основных требований, добавляется условие, что проведение гистохимических реакций не должно приводить к образованию артефактов. Это последнее определяет крайне медленное внедрение гистохимических методов в электронную микроскопию. Имеющиеся на сегодняшний день подобные методы и реакции, относящиеся в основном к реакциям выявления мест активности некоторых ферментов,- еще далеки от совершенства. Для выявления мест локализации ферментов в клеточных структурах ткани необходимо фиксировать таким образом, чтобы не разрушить их ферментов. Лучшими фиксаторами в этом отношении являются формалин и другие альдегиды [66]. Фиксированные, а затем отмытые кусочки ткани переносятся в инкубационные среды, где ферменты реагируют с субстратами, и на месте их активности откладываются или тяжелые металлы (теллур, свинец), или гистохимические реагенты (соли тетразо-лия). Такими способами можно исследовать локализацию различных дегидрогеназ [83], фосфатаз [84], ацетилхолинэстеразы [85] и др. После проведения инкубации ткани необходимо снова подвергнуть фиксации, но уже в осмиевых растворах, чтобы повысить контрастность. Такие ткани затем заключаются в пластмассы и из них приготовляются срезы. Инкубирование тканей в средах, содержащих субстраты, обычно приводит к изменению внутриклеточных структур, хотя в ряде случаев достигнуты отчетливые гистохимические |реакции при хорошей сохранности структур [66].
Некоторые вещества, такие, как нуклеиновые кислоты, можно выявлять прямо на срезах при помощи окраски уранилацетатом и солями свинца [10].
Ультратонкие срезы тканей, особенно после заливки в водорастворимые среды, можно подвергать воздействию различных ферментов для определения химической природы тех или иных структур [86].
Большие перспективы открываются перед внедрением в электронную микроскопию метода ауторадиографии. Срезы с тканей, меченых тритием (Н3), можно покрывать тонкими пленками фотоэмульсии и после экспозиции и проявления фотопленок, лежащих на срезах, определять в электронном микроскопе места связи изотопа со структурами клеток. Применение подобного метода ограничивалось двумя факторами: величиной зерен бромистого серебра и толщиной самой фотоэмульсии. Применение фотоэмульсий с крупными гранулами не давало преимущества перед обычной ауторадиографией. Толщина желатинового слоя эмульсий резко снижала контраст и четкость изображения в электронном микроскопе. В настоящее время используются мелкозернистые эмульсии [87—90], что позволяет повысить разрешение метода до 600—300 А. С другой стороны, контрастирование срезов, покрытых фотоэмульсией, щелочными растворами солей
