Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.
Скачать (прямая ссылка):
/г=1
электронов молекулы (N — число электронов в молекуле); d% — элемент объема.
Для сил осцилляторов имеет место важное утверждение, известное как правило сумм Томаса — Куна: сумма сил осцилляторов для перехода из основного состояния 0 во все возбужденные состояния равна числу электронов в молекуле:
(10)
i
В квантовой механике каждому переходу сопоставляется некоторый вектор (9), называемый дипольным моментом перехода (или просто моментом перехода), величина и направление которого могут быть найдены из расположения атомов в молекуле. Направление этого вектора совпадает с линией, по которой колеблется классический осциллятор. Таким образом, можно дать два определения поляризации перехода (полосы поглощения). Классическое определение: «Поляризация полосы поглощения — это направление колебаний линейного осциллятора, отвечающего этой полосе»; квантовомеханическое: «это направление вектора дипольного момента перехода». Основное различие между этими определениями заключается в том, что за классическим определением нет ничего, кроме возможности эмпирического нахождения поляризации, в то время как в квантовой механике существует принципиальная возможность вычисления поляризации, исходя из структуры молекулы.
Переходы, для которых интеграл (9) равен нулю, называются запрещенными. Это не значит, что они никак не проявляются в спектре (вследствие колебаний атомов поглощение все же происходит), но нх интенсивность значительно меньше интенсивности разрешенных переходов. Часто удается из простых соображений о оимметрии молекул определить, какой переход является запрещенным, а у многих разрешенных переходов определить поляризацию. Однако если простых соображений оказывается недостаточно, то задача становится практически неразрешимой из-за математических трудностей, возникающих при нахождении волновых функций i|>0 и г|5г-.
б. Измерение спектров
Спектры растворов биополимеров обычно измеряются в воде или в органических растворителях1. Для измерений, как правило, достаточно иметь прибор, работающий в ближней ультрафиолетовой области, однако в некоторых случаях (например, при измерении поглощения пептидной связи) необходимо работать в вакуумной ультрафиолетовой области.
На рис. 1 представлена блок-схема двухлучевого спектрофотометра. Луч света от источника L проходит через монохроматор и системой зеркал разделяется на два луча, один из которых проходит через чистый растворитель, а другой — через исследуе-
1 Большое значение для физических исследований имеет также исследование ориентированных пленок. Мы, однако, не будем затрагивать этот вопрос.
мый раствор. Затем лучи вновь соединяются и регистрируются детектором (фотоэлементом или фотоумножителем). Специальное устройство (изображенное на рис. 1 в виде двух зеркал, связанных пунктирной линией) попеременно пропускает луч то через одну, то через другую кювету. Поэтому на детектор попадает свет переменной интенсивности. Стоящее за детектором устройство позволяет отделить сигнал, прошедший через раствор, от сигнала, прошедшего через растворитель. Далее сигналы усиливаются и измеряется их отношение. Применение двухлучевой системы позволяет избежать таких помех, как нестабильность источника света, нестабильность приемника и т. д.
у . А,
Монохроматор
Рис. 1. Блок-схема оптического устройства современного двухлучевого
спектрофотометра
При исследовании биополимеров большое значение имеет измерение спектров при различных температурах. Для такого рода измерений кювету необходимо снабдить термостатирующим устройством, позволяющим быстро менять температуру и надежно ее поддерживать. При температурных измерениях появляется ряд методических затруднений. При нагревании свежеприготовленных водных растворов на рабочих стенках кюветы появляются пузырьки воздуха, которые могут существенно изменить оптическую плотность, уменьшая длину пути, проходимую светом в растворе, и увеличивая интенсивность рассеянного света. Для предупреждения появления пузырьков кюветы следует тщательно промывать перед употреблением. Определенную опасность представляет также испарение растворителя, что приводит к увеличению концентрации раствора. Так как используемые обычно прямоугольные кюветы не предназначены для герметизации, укажем некоторые способы борьбы с испарением: на поверхность раствора наносится тонкий слой чистого силиконового масла; кювета плотно закрывается тефлоновой пленкой, которая прижимается сверху крышкой с резиновой прокладкой. Ни в коем
Ь
1 Кюдетное отделение
1
| * ---1-1--Ъ
< ^-ЕЕЗ-Ч- оА
\
\
\ -"Т
случае не следует пользоваться кварцевыми крышками, прилагаемыми к кюветам СФ-4, так как раствор затягивается в зазор между крышкой и стенкой кюветы и при нагревании расширяющийся воздух выталкивает его наружу; чтобы предотвратить это, верхнюю часть кюветы смазывают гидрофобным силиконовым маслом.
