Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.
Скачать (прямая ссылка):
Мелкие объекты можно фиксировать в парах сильно летучей четырехокиси осмия, но для большинства объектов обычно используют забуференные растворы этого вещества. Одним из универсальных фиксаторов считается раствор четырехокиси
7* 99
осмия в ацетатвероналовом буфере по Паладе [63], используемый при pH 7,2.
Другим фиксатором, широко применяемым в электронной микроскопии, является формалин. Он быстро проникает в клетки, хорошо стабилизирует белки, образуя связи между белковыми цепями, хорошо сохраняет жиры и липоиды [64]. Обработка клеток формалином с последующей промывкой водой сохраняет в активном состоянии многие ферменты, что используется для проведения гистохимических реакций при исследовании клеток в электронном микроскопе (см. ниже). Клетки после фиксации формалином не обладают такой четкой и контрастной внутренней структурой, как при осмиевой фиксации [65]. Поэтому для контрастирования компонентов клеток после фиксации формалином применяется дополнительная обработка солями тяжелых металлов или вторичная фиксация в растворах четырехоки-си осмия. Последняя процедура предохраняет белки, фиксированные формалином, от коагуляции при обезвоживании клеток в спиртах. Ткани, фиксированные в формалине, лучше всего заключать в эпоксидные смолы.
Недавние исследования Бернетта [66] привели к находке новых фиксаторов, в состав которых входят альдегиды. Глюта-ральдегид, глиоксаль, кротональдегид, ацетальдегид и другие, хорошо фиксируя и сохраняя структуры, не влияют на активность некоторых клеточных ферментов и могут с успехом применяться в электронномикроскопической гистохимии.
Особенно хорошие результаты фиксации клеточных структур получены с глютаральдегидом. Этот фиксатор (4—6%-ный раствор глютаральдегида в фосфатном буфере при pH 7,2—7,4) прекрасно сохраняет тонкие структуры цитоплазмы (микротрубочки, тонофибриллы, мембраны, хромосомы). Но структуры клетки 'после такой фиксации обладают низким контрастом, поэтому необходима последующая обработка объектов растворами четырехокиси осмия.
Для выявления мембранных структур клеток, основным компонентом которых являются липопротеины, с успехом применяется перманганат калия [67], который плохо сохраняет гранулярные и фибриллярные структуры ядра и цитоплазмы.
Несмотря на то, что различные фиксаторы по-разному действуют на клетки, было обнаружено удивительное однообразие в строении клеточных компонентов при разных способах фиксации. Это давало основание думать, что электронная микроскопия имеет дело со структурами, во всяком случае близкими по своим морфологическим свойствам к прижизненным. Еще большую уверенность в этом исследователи получили тогда, когда для стабилизации клеточных структур был применен качественно иной, физический метод фиксации. При помощи быстрого и глубокого замораживания с последующей сушкой в высоком ва-
кууме и пропиткой заливочными средами ряду авторов удалось показать, что при такой обработке клеток их внутренняя структура оказалась сходной с той, что мы видим после фиксации осмиевыми растворами [68]. Если при химической фиксации в водных растворах из тканей экстрагируется около половины сухого вещества клеток, то при замораживании и высушивании из клеток удаляется только вода. При этом не происходит дислокаций веществ внутри цитоплазмы и ядра, и химическая структура различных клеточных компонентов тоже не изменяется. Срезы с таких лиофилизированных клеток выглядят более темными. Светлые, как бы пустые, пространства, обнаруживаемые в полостях мембранных структур при химических фиксациях, теперь оказываются заполненными различными веществами, а темные осмиофильные мембраны становятся светлыми. Структура эргастоплазмы, ядерных оболочек, митохондрий остается в принципе очень похожей на таковую при химической фиксации.
При лиофилизации возможно проявление ряда артефактов, связанных с образованием мелких кристаллов льда в клетках, которые изменяют внутриклеточные компоненты. Чтобы избежать этого, необходимо глубокое (до —170°) и быстрое, моментальное охлаждение объектов для предотвращения роста кристаллов льда. Обычно для этого свежевырезанную ткань помещают в охлажденный жидким азотом изопентан, обладающий высокой теплопроводностью. После этого ткань в охлажденном состоянии (примерно при —75°, чтобы не вызвать рекристаллизации льда) помещают в вакуумную систему, где при большом разрежении начинают откачку паров воды. После такого обезвоживания ткань может быть пропитана заливочной средой и из нее можно изоготовить ультратонкие срезы.
б. Заливка
Для изготовления ультратонких срезов толщиной 300— 600 А необходимо, чтобы заливочный материал обладал нужной твердостью, эластичностью и другими свойствами, очень важными для исследования срезов в электронном микроскопе. Чаще всего для этих целей используются некоторые пластические массы (метакрилаты, эпоксидные смолы, полиэфирные смолы), а также желатина. Поэтому весь процесс обработки объекта после фиксации находится в зависимости от того вещества, в которое будет заключен материал. Чаще всего для приготовления ультратонких срезов в качестве заливочного материала используют метакрилаты, которые хорошо смешиваются с большинством органических растворителей и не смешиваются с водой. Следовательно, подобно гистологической заливке в парафин, сначала объект необходимо обработать так, чтобы метакрилат мог полностью его пропитать. Это обычно достигается путем дегид-
