Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Лазуркина Ю.С. -> "Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот" -> 41

Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.

Лазуркина Ю.С. Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот — Наука, 1967. — 343 c.
Скачать (прямая ссылка): fizmetodiisledovaniyabelkov1967.djvu
Предыдущая << 1 .. 35 36 37 38 39 40 < 41 > 42 43 44 45 46 47 .. 133 >> Следующая

ратации тканей или клеток при помощи нескольких смен спиртов (метилового или этилового) или ацетона возрастающей концентрации.
Объекты не обнаруживают значительных морфологических различий при обезвоживании в различных средах, за исключением ацетона, который хорошо экстрагирует липиды.
При обезвоживании, так же, как и при фиксации, необходимо соблюдать определенные условия, чтобы исключить появление дополнительных артефактов. Нужно помнить, что в результате этого процесса происходит сжатие объектов (до 30%), вызываемое не только потерей воды, но и экстракцией части материала (особенно липидов в ацетоне). По данным Сильвена [69], ткани теряют после фиксации и обезвоживания 40—60% своего сухого веса. Поэтому обезвоживание необходимо проводить как можно быстрее, с учетом способности применяемого реактива экстрагировать те или иные клеточные компоненты. Обезвоживание должно быть полным, так как недостаточное удаление воды из объекта при заключении его в пластмассу вызывает значительные повреждения в тканях и клетках из-за неравномерной и неполной полимеризации заливочного материала. Резкая смена концентрации спиртов вызывает резкое сжатие объектов. Поэтому целесообразно применять спирты с постепенным увеличением концентрации. Следующим этапом в процессе обработки тканей после обезвоживания является их пропитка и заключение в пластмассы или другие среды.
Используемые для этих целей вещества должны отвечать следующим требованиям: иметь низкую вязкость в мономерном состоянии для того, чтобы свободно проникать в объект; полностью смешиваться с веществом, в котором ведется дегидратация (спирт, ацетон и др.); при полимеризации не должен меняться объем, занимаемый мономером; полимеризованная среда вместе с заключенным в нее объектом должна быть годной для изготовления ультратонких срезов; среда не должна влиять на качество изображения объекта.
Применяемые в настоящее время среды для заливки объектов, к сожалению, всеми этими качествами не обладают. Так, метакрилаты могут повреждать объекты, а также сублимируют под лучом электронов и тем самым вносят дополнительные артефакты. Эпоксидные смолы наиболее пригодны для заливок, но очень снижают контрастность изображения [70]. Полиэфиры (Ве-сто-пал W) дают очень твердые блоки и смешиваются только с ацетоном 171]. Заключение в желатин приводит к сжатию объектов (72].
Самым распространенным и легкодоступным способом для заключения объектов в электронной микроскопии является помещение их в метакрилаты. Для этих целей используют я-бутил-метакрилат и я-метилметакрилат— эфиры метакриловой кисло-
ты. Они хорошо смешиваются в мономерном (жидком) состоянии с большинством органических растворителей [73]. Метакрилаты легко проникают в ткани, достаточно хорошо обработанные спиртом или ацетоном. Полимеризация их может быть вызвана действием тепла, света, ультрафиолетовым излучением или же химическими веществами-инициаторами.
При полимеризации молекулы мономера образуют короткие (из нескольких десятков молекул) или длинные (из нескольких десятков и сотен тысяч молекул) цепи в зависимости от условий реакции. При полимеризации ft-бутилметакрилата образуются мягкие блоки, а при полимеризации к-метилметакрилата—твердые. Таким образом, сочетая разные количества этих двух мономеров, можно получить блоки желаемой твердости. Так, при добавлении 10—20% ft-метилметакрилата к н-бутилметакрилату увеличивается твердость блоков и они становятся подходящими для более твердых тканей, таких, как печень и мышцы.
В биологических исследованиях для полимеризации метакрилатов используются главным образом дихлорные перекиси бензоила как инициаторы (в литературе их чаще называют катализаторами) полимеризации. После добавления перекиси бензоила полимеризация метакрилатов может происходить и при комнатной температуре, однако этот процесс занимает слишком много времени (несколько суток). Обычно, реакцию полимеризации проводят при температурах 45—60° в термостатах. Бориско [74] нашел, что повышение температуры при полимеризации метакрилатов до 80° не влияет на качество препаратов, однако оптимальной температурой, при которой процесс полимеризации завершается за 12—18 час., является 60°.
Процедура заливки объектов довольно проста. После фиксации и обезвоживания они пропитываются в смесях метакрилатов и переносятся -в желатиновые капсулы, наполненные метакрилатами (рис. 29). Капсулы помещают в термостат, где и завершается полимеризация метакрилатов, в которые заключены объекты. Более подробно эти процессы описаны в специальных руководствах [10, 75].
Один из существенных недостатков метакрилатов — повреждение объектов в процессе полимеризации. Это выражается в том, что часть объектов (особенно крупных) набухает и разрушается, особенно на периферии, тогда как в центре объекта клетки почти не изменяются, что особенно мешает в работе с культурами ткани. Повреждения возникают в результате неравномерного и нестабильного затвердевания полимера в присутствии следов воды или при повышенном содержании кислорода. По этим же причинам другое неудобство метакрилатов — появление в блоках пузырьков, часто располагающихся непосредственно на объектах. Для борьбы с полимеризационными повреждениями Бориско предложил, с одной стороны, использовать
Предыдущая << 1 .. 35 36 37 38 39 40 < 41 > 42 43 44 45 46 47 .. 133 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed