Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.
Скачать (прямая ссылка):
Распределение концентрации в полосе при равновесной седиментации в градиенте плотности можно исследовать как в аналитической, так и в препаративной ультрацентрифуге. В последнем случае используются роторы с откидными стаканами. После достижения равновесия содержимое пробирок анализируется аналогично тому, как это делается в опытах с градиентом сахарозы (см. соответствующий раздел). Время установления равновесия как в аналитическом, так и в препаративном опыте может быть оценено из соотношения:
где D — коэффициент диффузии исследуемого вещества; L —высота слЬя в кювете или пробирке по радиусу ротора; а — ширина гауссового распределения.
Обычно время достижения полного равновесия составляет от 12 до 60—70 час.
В аналитических ультрацентрифугах регистрация результатов ведется как методом поглощения света, так и методом Фильпота— Свенссона. Первый метод применяется для малых концентраций веществ, поглощающих в ультрафиолетовой области. Здесь необходимо подчеркнуть, что в этом случае следует
работать с выдержками, обеспечивающими линейную зависимость почернения пленки от концентрации. Для правильного выбора концентрации вещества в полосе можно воспользоваться следующим соотношением между начальной концентрацией с0 полимера в растворе и конечной концентрацией ск в полосе:
1 Lf А Л L
Со = • ск =0,40
У2п <* а
с
(в частности, при сг=0,02 см — =24).
с0
Если в опыте используется абсорбционный метод, оптика Фильпота — Свенссона служит для регистрации градиента плотности раствора. Этот метод может применяться и для самостоятельного изучения вещества в градиенте плотности.
В методе Фильпота — Свенссона для повышения точности применяется двухсекторная кювета. Выбор начальной концентрации исследуемого вещества может быть произведен по формуле
&с 0,40 LcK
--- = Hh -------- •
У7 о2
На рис. 32 и 33 приведены примеры измерений, выполненных методом поглощения в ультрафиолете и методом Фильпота — Свенссона.
Месельсон, Шталь и Виноград [50], впервые предложившие метод установившегося градиента плотности, показали, что для гомогенного вещества ширина полосы связана с молекулярным весом соотношением,
о2 =---------------, (34)
I dp \ '
где R — газовая постоянная; Т — абсолютная температура; ро —*
dp
плотность растворителя в центре полосы; j-_________градиент плот-
ности; х — расстояние от оси вращения до центра полосы;
г
¦
1
г з
Рис. 32. Распределение ДНК Streptomyces virictochro-mogenes и ДНК легкого мыши в градиенте плотности CsCl. Полоса 1 соответствует ДНК Streptomyces viridochromogenes. р=1,729 г/см3, полосы 2 и и 3 — ДНК легкого мыши р =1,701 и 1,690 г/см3 [48]
Рис. 33. Распределение растворимого коллагена в прадиенте плотности CsBr. Концентрация коллагема 0,3 мг/мл. Фотография получена при помощи метода Фильпота — Свенссона {49]
о) — угловая скорость; М — молекулярный вес; о — дисперсия гауссова распределения, для гомогенного вещества.
• Для нахождения дисперсии а необходимо экспериментально определить распределение концентрации вещества в полосе и построить график: — 1пс, + In с„ т. е. зависимость Inc от х2 (33).
Для гомогенного вещества эта зависимость линейна и сг определяется по тангенсу угла наклона, равному . Наличие полидисперсно-
сти по молекулярному весу вызывает искривление этой прямой, обращенное выпуклостью вверх. Выпуклость вниз указывает на наличие полидисперсностн плотности. Прн наличии полиднсперсности только по молекулярному весу формула (34) дает так называемый среднечисленный молекулярный вес Мп {см. примечание, стр. 231). Наличие полиднсперсности по плотности весьма усложняет задачу, так как в этом случае дисперсия гауссова распределения состоит из двух независимых членов, требующих их раздельного определения:
а = от -Ь (35)
Здесь От — дисперсия, вызванная тепловым движением (т. е. диффузией) макромолекул; сгр — дисперсия, обусловленная полндиспер-спостъю плотности.
Только в некоторых частных случаях, когда возможно независимым способом вычислить среднечнсленный молекулярный вес, а затем, пользуясь формулой (34), вычислить от, дисперсию Ор определяют из выражения (35). Возможность применения такого способа оценки полиднсперсности плотности была показана Суеока [51] для ДНК тимуса теленка. Таким образом, к оценке молекулярного веса методом седнментацнонного равновесия в установившемся градиенте плотности необходимо подходить осторожно. Основной величиной, определяемой этим методом, является плотность исследуемой частицы, которая вычисляется с точностью до 0,001 г/см3. Плотности макромолекул лежат в широком интервале значений: от ~1,3 г(мл (для белков), до —1,7 г/мл (для ДНК); РНК при плотности 1,9 г/мл еще седи-ментнрует. При надлежащем выборе растворителя этот метод позволяет исследовать обширный класс веществ. Если в градиенте ‘плотности находится несколько образцов макромолекул, то достаточно хорошее разрешение полос получается уже прн разности плотностей макромолекул порядка нескольких сотых г/смъ. Описанный метод дает возможность получать уникальную информацию о зависимости плотности от химического состава молекулы [50], о механизме репликации ДНК и переносе генетической информации [53, 54], о процессах денатурации и ренатура-ции ДНК [55, 56]. Метод применим также для исследования белков [49, 57] и синтетических полимеров [58]. Наиболее полную
