Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.
Скачать (прямая ссылка):
Рис. 23. Распределение по коэффициентам седиментации ДНК тимуса теленка. Концентрация ДНК 40 мг/мл [39]
вия седиментации в градиенте плотности отличны от описанных выше.^При седиментации в градиенте плотности раствор, содержащий смесь исследуемых макромолекул, осторожно наслаивается на мениск раствора сахарозы и молекулы седиментируют из верхнего слоя в раствор сахарозы, так что со временем наступает полное разделение седиментирующих компонент (рис. 25).
а с б
в
Рис. 24. Схематическое изображение устройства для создания градиента сахарозы
Рис. 25. Разделение веществ при седиментации в градиенте плотности
а — начало опыта (смесь двух веществ наслоена на мениск раствора сахарозы); б — частичное разделение веществ спустя некоторое время; в —момент времени, соответствующий разделению веществ на зоны
При разделении веществ обычным способом, без градиента плотности и наслоения, возможно соосаждение компонент, имеющих различную скорость седиментации. Так, в роторе, дно пробирки которого отстоит от оси вращения приблизительно на двойном расстоянии по сравнению с мениском раствора, быстро осевшие компоненты будут иметь в виде примеси около 40% вещества, седиментирующего втрое медленнее, и около 13% вещества, имеющего в 10 раз меньшую скорость седиментации [41], в то время как в градиенте плотности достигается полное разделение. Кроме обычных факторов разделения, действующих при седиментации,— молекулярного веса компоненты и формы молекулы, в условиях градиента плотности при разделении играет роль также плотность молекул. Это означает, что компонента с плотностью, близкой или равной плотности раствора сахарозы, будет двигаться медленнее или вообще не будет седиментировать в отличие от молекул такого же молекулярного веса и формы, но с большей плотностью. Ченгом и Шахманом [42] показано, что если средняя разность между плотностью частиц и плотностью растворителя составляет 0,052 г/мл, то различие в плотностях частиц на 0,01% изменяет скорость седиментации также только
на 0,01%. Если средняя разница между плотностью растворителя и плотностью молекул составляет 0,001 г/мл, а разница в плотностях молекул по-прежнему равна 0,01%, то скорости седиментации отличаются уже на 10%.
После разделения седиментирующего материала на зоны (см. рис. 25, в) центрифугирование прекращают и содержимое пробирки фракционируют, либо разрезая ее специальным устройством на слои, либо сливая по каплям, через дно пробирки, проколотое иглой шприца (наличие градиента на объем капель практически не влияет). Последующий анализ радиоактивности фракций, оптической плотности или ферментативной активности дает возможность установить распределение зон по высоте пробирки, и так как путь, пройденный частицей в линейном градиенте плотности, пропорционален времени центрифугирования, то можно также определить коэффициент седиментации с точностью ~3% [40, 43]. Соответствующий расчет несложен, но громоздок, требует графического интегрирования и поэтому здесь не приводится. Однако заметим, что если в исследуемом растворе имеется одна компонента с известным коэффициентом седиментации, то его можно определить и для других компонент, пользуясь соотношением
Li __ S20, Wt
^2 S20f W2
где L\ — путь, пройденный частицей с неизвестным коэффициентом седиментации s2<d,wx ; L2 — то же, для частицы с известным коэффициентом седиментации s2q,w2.
Аналогично можно оценить молекулярный вес частиц с близкой конфигурацией:
S20, tt>! _ f Ml N I*
S20, Ш2 \ /
в соответствии с выражением (24).
Метод седиментации в градиенте плотности широко распространен в практике биохимических исследований ввиду его хоро^ шей разделяющей способности. Он позволяет разделять нуклеиновые кислоты, фракционировать белки, а также некоторые субклеточные структуры.
д. Метод седиментационного равновесия и приближения к седиментационному равновесию
Предыдущее рассмотрение процессов седиментации относилось к центробежным полям, которые были столь велики, что вызывали седиментацию и разделение молекул, нарушаемые диффузией лишь в относительно небольшой степени. При меньших значениях центробежного поля, когда перенос вещества под дей^
ствием центробежного ускорения сравним с диффузионным потоком вещества, происходит перераспределение концентрации по кювете, характер которого зависит от молекулярного веса исследуемого вещества. При достаточно длительном центрифугировании устанавливается равенство ‘седиментационного и диффузного потоков, направленных навстречу друг другу (седимента-
Рис. 26. К выводу уравнения седиментационного
равновесия
ционное равновесие). Такое равновесное распределение концентрации по кювете позволяет определить молекулярный вес образца [26, 27].
Метод седиментационного равновесия широко применяется для изучения белков, полипептидов и веществ с большими коэффициентами диффузии. Для биополимеров с малым коэффициентом диффузии, например для нативной высокополимерной ДНК, этот метод непригоден из-за очень большого времени установления равновесия.
