Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Лазуркина Ю.С. -> "Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот" -> 106

Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.

Лазуркина Ю.С. Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот — Наука, 1967. — 343 c.
Скачать (прямая ссылка): fizmetodiisledovaniyabelkov1967.djvu
Предыдущая << 1 .. 100 101 102 103 104 105 < 106 > 107 108 109 110 111 112 .. 133 >> Следующая

Если коэффициент диффузии необходимо привести к стандартным условиям, то, учитывая выражение (17), аналогично
17 Физические методы исследования белков
257
выводу уравнения (21) можно получить выражение для приведенного коэффициента диффузии:
где индекс t относится к условиям опыта, а индекс 0 — к стандартным условиям; t — температура, в °С.
Для измерения молекулярных весов необходимо определение величины (1 — Vpp) в выражении (19). Значение парциального удельного объема V для белков лежит между 0,70—0,75 мл/г, а плотность растворителя (водный буферный раствор) близка к единице. Таким образом, точность определения молекулярного веса в значительной мере зависит от точности определения парциального удельного объема V. Стандартный метод определения V заключается в измерении пикнометрическим способом (взвешивание фиксированных объемов растворителя и раствора) плотности растворителя рр и плотности раствора р с концентрацией растворенного вещества, равной с г/мл. Удельный парциальный объем определяется из выражения:
Для белка или полипептида, аминокислотный состав которых известен, парциальный объем может быть вычислен на основании парциальных объемов аминокислот [36, 37].
Для некоторых веществ выражение (19), при помощи которого определяются молекулярные веса белков и синтетических полимеров, не может быть использовано для этой цели ввиду невозможности определения коэффициента диффузии (вещество нестабильно и разлагается за время диффузионного опыта или имеет очень малый коэффициент диффузии). К таким веществам относятся нуклеиновые кислоты. В этом случае молекулярный вес можно определить по формуле Манделькерна — Флори:
где [г|] — характеристическая вязкость; s° — константа седиментации; Mw —средневесовой молекулярный вес; Na—число Авогад-ро; г|о — вязкость растворителя; рр—плотность растворителя; р — параметр, определяющий степень доступности объема, занятого макромолекулой, для молекул растворителя.
Таким образом, применение этой формулы требует определения трех основных величин: характеристической вязкости [г|], константы седиментации s° и параметра р, который может также зависеть от молекулярного веса. Для большого класса линейных
s° h]VsTi0A^ ]8/г
(24)
¦W —
3(1-1%) J,
цепных макромолекул параметр |3 постоянен в широком диапазоне молекулярных весов и в среднем близок к величине 2,5 • 106. В настоящее время накоплен и "обобщен большой материал для установления зависимости характеристической вязкости [т]] и константы седиментации s° от молекулярного веса ДНК различного происхождения [8]. Молекулярный вес ДНК определялся либо методом светорассеяния (до М=3-106), либо (для более высоких М)-аутора диографи чески при помощи электронного микроскопа. На рис. 22 приведена зависимость от средневесового молекулярного
веса Mw при концентрации NaCl в растворе от 1 до 0,1 М
Рис. 22. Зависимость константы седиментации Sjo, w от молекулярного веса нативной ДНК [8]
(см. также рис. 10.) Используя общую зависимость s^0 w1 нативной ДНК от молекулярного веса (рис. 22), можно оценить молекулярный вес исследуемой ДНК непосредственно из кривой. Кроме того, возможно использование эмпирических выражений, полученных из этой кривой:
S-20 ,w — 0,116Л1°’326 (для молекулярного веса от 0,3 до 3 млн.);
S2o, ш = 0.034Л10’405 (для молекулярного веса свыше 3 млн.).
Коэффициент р, определенный по данным, приведенным на рис. 10 и'22 (М, [г]] и Sao.t») и из выражения (24), слабо зависит от молекулярного веса, совпадает с теоретически вычисленной зависимостью для полужесткой цепной молекулы и лежит в интервале значений ’от 2,70-10® до 2,2;Ю6 при среднем значении 2,5-10®.
1 Константа седиментации s“0 w :,!0жет быть заменена коэффициентом седиментации s, если он определен при концентрации раствора не более
2 • 10~2 мг)мл ДНК. Отличие от константы седиментации составляет в этом случае не более нескольких процентов.
Аналогичный подход возможен для определения молекулярного веса денатурированной ДНК, РНК и синтетических полинуклеотидов.
Из седиментационных диаграмм можно получить сведения чистоте препарата и его полидисперсности. Наличие несколькил границ свидетельствует о полидисперсности анализируемого раствора. При наличии примесей с близкими седиментационными свойствами граница единственна, но асимметрична (см. рис. 16). Полный анализ формы и ширины границы седиментации может дать св'едения о форме распределения молекул полидисперсного препарата.по молекулярным весам.
Расширение границы гомогенного препарата обусловлено только диффузией. Форма границы описывается сложным аналитическим выражением [27], которое, однако, упрощается при условии a2stkl. Это дает возможность получить простое выражение для так называемого «кажущегося» коэффициента диффузии:
где ct — концентрация исследуемого вещества в области плато; dc
— —максимальная величина градиента концентрации в пере-dx
ходной зоне (граница седиментации); t — время, в сек\ со — угловая скорость, в цек~\ s — коэффициент седиментации1.
Предыдущая << 1 .. 100 101 102 103 104 105 < 106 > 107 108 109 110 111 112 .. 133 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed