Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
Источники: 11, 57.
Определение малонового диальдегида в крови. Принцип. При высокой температуре в кислой среде малоновый диальдегид (МДА) реагирует с 2-тиобарбитуровой кислотой с образованием окрашенного триметинового комплекса, имеющего максимум поглощения при 532 нм.
Реактивы: 10%-ный водный раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ);
0,8%-ный раствор 2-тиобарбитуровой кислоты (2-ТБК) на дистиллированной воде. Готовят при нагревании в кипящей водяной бане в день исследований.
Оборудование: спектрофотометр или ФЭК; центрифуга лабораторная (лучше рефрижераторная); баня водяная; весы ана-
169
литические; пробирки химические и центрифужные; колбы мерные; пипетки с делениями разные.
Ход определения. К 2,5 мл гепаринизированной крови, внесенной в центрифужную пробирку, добавляют 2,5 мл раствора ТХУ, хорошо перемешивают стеклянной палочкой и центрифугируют при 3000 мин 1 в течение 15 мин и оставляют стоять на холоде 15 мин до образования крупных хлопьев. 3 мл надосадочной жидкости переносят в чистую центрифужную пробирку, прибавляют 1,5 мл раствора 2-ТБК и хорошо перемешивают. Затем пробы помещают в кипящую водяную баню на 15 мин (точно!). В ходе реакции развивается розовое окрашивание. Пробы вынимают из водяной бани, охлаждают под струей холодной воды и центрифугируют в течение 5 мин при 3000 мин-1.
Одновременно с опытными готовят контрольную пробу, куда вместо крови вносят 2,5 мл воды. Все остальные операции проводят как и с опытными пробами.
Полученный центрифугат осторожно, не встряхивая, переносят в химические пробирки и измеряют оптическую плотность опытных проб против контрольной при длине волны 532 нм в кювете с расстоянием между рабочими гранями 1 см.
Расчет содержания малонового диальдегида (продуктов переокисления) ведут по формуле
г= E- IQ6 - 3 1,56 105'
где С — концентрация МДА, мкмоль/л; E — оптическая плотность пробы; 106 — коэффициент пересчета в мкмоль/л; 3 — фактор разведения; 1,56•1O5 — коэффициент молярной экстинкции триметинового комплекса МДА с 2-ТБК.
Примечание. Время кипячения проб (15 мин) должно быть строго выдержано, так как в противном случае с 2-ТБК реагируют другие химические соединения, содержащиеся в крови и дающие окрашенные комплексы, имеющие максимум поглощения в той же области спектра, что и триметиновый комплекс. Клиническое значение. Активность свободноради-кального окисления липидов оценивают по накоплению липидных перекисей, которые определяют в форме малонового диальдегида (МДА). Повышение его концентрации свидетельствует об активизации процессов ПОЛ или о снижении антиоксидантной защиты организма. Это вызывается как эндогенными, так и экзогенными факторами, указанными выше.
Пониженная и стабильная концентрация продуктов ПОЛ, наоборот, свойственна здоровому организму с хорошо функционирующей антиоксидантной защитой. Концентрация МДА у млекопитающих животных колеблется от 0,20 до 1,5, а у кур до 1,50—2,50 мкмоль/л крови. Источники: 11, 18.
170
Определение флуоресцирующих оснований Шиффа. Принцип. Диальдегиды и ряд других конечных продуктов ПОЛ, взаимодействуя с N-концевыми остатками аминокислот, белков и аминогрупп фосфолипидов, образуют конъюгированные флуоресцирующие соединения типа оснований Шиффа. Эти соединения, представляющие собой комплексы липопротеидов, входящих в состав известного внутриклеточного образования — липофусцина («пигмента старения»), обладают выраженной стабильностью, медленной утилизацией и способностью накапливаться в организме. Флуоресцирующая способность его по сравнению с содержанием малонового диальдегида в 10—100 раз чувствительнее и не зависит от степени окисляемости системы. Соединения типа оснований Шиффа обладают высокой реактивной способностью и токсичностью, производя межмолекулярные «сшивки» и нарушения структур и функции биомембран.
Метод определения основан на измерении флуоресценции соединений типа оснований Шиффа, извлекаемых липидными растворителями из биологических материалов.
Реактивы: хлороформ; спирт метиловый; экстрагирующая смесь (ЭС); хлороформ-метанол 2 : 1 (об/об.); 0,1 н. раствор серной кислоты; стандартный раствор хинин-сульфата: 10 мг хинин-сульфата растворяют в 10 мл 0,1 н. растворе серной кислоты. Раствор может храниться в холодильнике в темной стеклянной посуде в течение 1 мес.
Оборудование: спектроколориметр «Спекол-10» с приставкой для измерения флуоресценции или спектрофотометр любой модели; весы аналитические; холодильник бытовой; центрифуга лабораторная; баня водяная; колбы мерные; пробирки химические и центрифужные; пипетки разного объема.
Ход определения. В центрифужные пробирки вносят по 1 мл сыворотки крови, приливают по 4 мл экстрагирующей смеси и тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Пробирки плотно закрывают корковыми пробками, помещают в водяную баню на 5 мин при температуре 30 °С, вынимают из бани и тщательно встряхивают в течение 1_мин. Затем пробы центрифугируют в течение 15 мин при 3000 мин-1. Водный слой осторожно отсасывают. Белковый слой протыкают стеклянной палочкой и нижний хлороформный экстракт липидов фильтруют в чистые пробирки через смоченный хлороформом бумажный фильтр. Измеряют флуоресценцию экстрактов при длине волны возбуждения 435—440 нм. Флуоресценцию стандартного раствора измеряют после его разведения в 1000 раз, до концентрации 1 мкг/л. Измеряют также флуоресценцию чистого хлороформа.
